中國美利奴羊(新疆軍墾型)胎兒期皮膚毛囊結構及形態學觀察

楊涵羽璐，楊永林，方晨輝，楊 華*，沈 敏，楊井泉，高 磊

(1.新疆農業大學動物科學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000；3. 新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所，新疆 石河子 832000；4. 塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

【研究意義】毛囊是皮膚重要的附屬器官，是羊毛生長發育及羊毛品質的基礎，毛囊發育影響著細度、密度、強度和長度等羊毛重要的經濟性狀，決定羊毛的質量。【前人研究進展】研究表明，毛囊由8個獨特的細胞群構成，是哺乳動物中最典型也是最復雜的微小器官之一，也是哺乳動物唯一具有生命周期的生長器官[1-4]。毛囊發育始于胚胎期的外胚層和中胚層，胎兒期的毛囊發育對出生后的羊毛發生、發育都有影響。因此，研究胎兒期毛囊發育的形態特征與分化結構變化可為細毛羊的選育奠定基礎。毛囊發育中，許多信號通路相互作用參與了毛囊周期交替，真皮和表皮細胞群之間相互作用產生了毛囊[5]。毛囊在胚胎發育后期發生，不同毛囊的功能和基因表達不同，毛囊分為初級毛囊(PF)和沒有汗腺的次級毛囊(SF)，次級毛囊決定羊毛品質和產量[6]。Galbraith和Rogers研究發現，在綿羊胚胎發育50 d左右時，皮膚逐漸開始形成初級毛囊，次級毛囊在胚胎發育到85 d時開始出現，到羔羊出生時，所有毛囊都已形成，初級毛囊雖然都已經成熟，但次級毛囊尚未成熟[7-8]。中國超細毛羊(甘肅型)在胎兒期84 d時初級毛囊在皮膚一側開始發生[9]。【本研究切入點】中國美利奴羊(新疆軍墾型)是利用澳洲美利奴公羊作為父本，波爾華斯羊與新疆細毛羊作為母本，采取級進雜交的方法于1972年在新疆紫泥泉種羊場培育成功。該品種羊毛的毛叢結構閉合良好，各部位毛纖維長度與細度均勻，羊毛細度為60～64支以上，所產的羊毛是經濟價值非常高的天然紡織原料。而針對中國美利奴羊(新疆軍墾型)初級毛囊和次級毛囊發育的時間點及形態變化特征報道較少。【擬解決的關鍵問題】本文研究中國美利奴羊(新疆軍墾型)11個胎兒期毛囊發育形態結構變化與發育規律，分析毛囊特征參數與毛性狀間的相關性，為優質超細毛羊的培育工作提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇新疆農墾科學院種羊場50只2.5歲健康的中國美利奴羊(新疆軍墾型)經產母羊(平均羊毛纖維直徑為17.5±0.5 μm)，在相同的飼養管理條件下喂養，嚴格執行防疫和驅蟲。根據種羊系譜信息，應用同品種的種公羊(平均羊毛纖維直徑16.6±0.5 μm)配種，準確記錄配種時間。采樣時間從2017年9月15日至2018年3月1日，以胎兒發育的45 d開始，每10 d為1個采樣期，分別為45 d(第1時期)、55 d(第2時期)、65 d(第3時期)、75 d(第4時期)、85 d(第5時期)、95 d(第6時期)、105 d(第7時期)、115 d(第8時期)、125 d(第9時期)、135 d(第10時期)和145 d(第11時期)，每個發育時期采集3只胎羊的體側部皮膚組織，共33個胎兒，皮膚組織用1×PBS洗滌，放入4 %多聚甲醛保存，備用。

1.2 主要儀器設備

RM2235石蠟切片機(Leica，德國)，恒溫水浴槽，石蠟包埋冷臺(EG1130)，染片機(Leica CV5030)，自動封片機(Leica)，正置顯微鏡(Nikon)，切片架，烘干箱等。

1.3 主要試劑

試劑均為分析純，無水乙醇、二甲苯、多聚甲醛、蘇木素染液、伊紅染液(北京索萊寶科技)；專用包埋石蠟(上海華靈)；中性樹脂。

1.4 試驗方法

1.4.1 石蠟組織切片制作 將采集的各個時期的皮膚組織修剪為1 cm2的小方塊，用1×PBS沖洗，然后放入4 %多聚甲醛內固定 24 h 以上。將固定好的組織塊修整后，用1×PBS緩沖液沖洗，經過不同濃度乙醇梯度脫水。用二甲苯透明處理，浸蠟，石蠟包埋。將包埋好的蠟塊放到切片機上，根據毛囊生長方向，切為5 um的橫切和縱切組織切片，隨后用烘片機烘干切片的水分，固定1 h后取出，放在切片架上37 ℃干燥。應用蘇木精和伊紅進行HE染色。

1.4.2 統計方法 在顯微鏡下觀察皮膚毛囊組織切片，根據切片比例尺計算視野面積，計算總毛囊數、初級毛囊密度、次級毛囊密度、次級毛囊密度/初級毛囊密度比值(S/P)。用SPSS24.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 胎兒皮膚發育變化

從圖1-A～B可見，毛囊在胚胎時期開始形成，從毛囊原始體發育形成一套完整的不斷產生羊毛纖維的毛囊組織，毛囊和胎兒皮膚細胞同時發育。胎兒45～55 d是皮膚發育的時期，皮膚明顯地分為表皮層、真皮層、皮下結締組織3層。

2.2 毛囊形態發生變化

從圖1-C～K可見，在胎兒發育65 d時，出現毛囊原始體，隨著細胞大量增殖，在毛囊原始體的部位出現一個囊泡，然后開始向真皮層伸入生長。到胎齡85 d時，毛囊從真皮層一直延伸到皮下結締組織。汗腺和皮脂腺等附屬物也逐漸形成，開始出現立毛肌的組織。管狀物中充滿了生長細胞，形成毛原錐體，其一側出現皮脂腺和汗腺，汗腺向下直達皮膚最下層。立毛肌發育成熟，一端連接在發生發層上，另一端深入毛囊下部。管狀下端與毛乳頭相聯結，細胞不斷增殖而膨大，包圍毛乳頭，形成毛球。次級毛囊開始發生，排列在初級毛囊周圍(圖1-E)。原始次級毛囊(SO)在初級毛囊(PF)附近以及初級毛囊之間開始形成。胎齡105 d時，次級毛囊和初級毛囊之間派生出再分化次級毛囊(SD)。毛纖維最后穿過表皮伸出體外，形成毛管(圖1-G)。初級毛囊周圍會出現原始的次級毛囊和再分化次級毛囊，形成線性三毛囊群(PLX)(圖1-H)。從115～145 d毛囊的橫切面可以看出，皮脂腺和汗腺都可以與中央毛囊群(PCX)相關聯。最早發育的次級毛囊出現在離初級毛囊最遠的毛囊群周圍，而最近的次級毛囊往往出現在中央初級毛囊之間。

A:胎兒期45 d(400×)； B：胎兒期55 d(200×)； C：胎兒期65 d(200×)； D：胎兒期75 d(200×)； E：胎兒期85 d(200×)； F：胎兒期95 d(400×)； G：胎兒期105 d(100×)； H:胎兒期115 d(100×)。a1:表皮；a2：皮下結締組織；b1：表皮；b2：真皮；b3：皮下結締組織；c：囊泡；d：毛芽；e1：初級毛囊；e2：次級毛囊；f1：毛球 f2：初級毛囊；f3：次級毛囊；g1：毛管；g2：外根鞘；g3：毛干；g4：真皮毛乳頭；h1：連接組織鞘；h2：真皮毛乳頭；h3：毛球；h4：再分化次級毛囊A：45 days of fetal period(400×); B: 55 days of fetal period(200×); C: 65 days of fetal period(200×); D: 75 days of fetal period(200×); E: 85 days of fetal period(200×); F: 95 days of fetal period(400×); G: 105 days of fetal period(100×); H: 115 days of fetal period(100×). a1: Epidermis; a2: Subcutaneous connective tissue; b1: Epidermis; b2: Dermis; b3: Subcutaneous connective tissue;c: Epidermis plug; d: Hair germ; e1: Primary follicle; e2: Secondary follicle; f1: Hair bulb; f2: Primary follicle; f3: Secondary follicle;g1: Hair canal;g2: Outer root sheath; g3: Hair shaf; g4: Dermal papilla; h1: Connective tissue sheath; h2:Secondary follicle; h2: Dermal papilla; h3: Hair bulb; h4: Re-differentiation secondary follicle圖1 11個胎兒期皮膚毛囊形態發生變化(縱切)Fig.1 Morphology changeable process of skin hair follicle in 11 fetal periods

2.3 毛囊密度與S/P值計算

通過胎兒期85～115 d橫切切片圖(圖2)可見，隨著次級毛囊的發生，原始次級毛囊會再分化次級毛囊，次級毛囊數量越來越多，再分化次級毛囊會決定后期毛囊數目，繼而影響毛性狀經濟價值。隨著毛囊發育毛囊會逐漸增大。進一步統計次級毛囊與初級毛囊密度，表1為統計分析的胎兒期85～145 d毛囊密度及S/P值，可見初級毛囊密度隨著胎齡的先增加后減小，初級毛囊密度在95 d最大。

表1 胎兒期85～145 d毛囊密度及S/P值Table 1 Hair follicle density and S/P ratio from 85 to 145 days fetus

次級毛囊密度隨著胎齡的增長也呈先增加后減小，次級毛囊密度在115 d最大。次級毛囊數量/初級毛囊數量(S/P)值隨著發育階段逐漸增大，在135 d時S/P值達到最大值4.45。

3 討 論

毛發是哺乳動物的典型特征，具有調節體溫、保護和偽裝等功能。毛發是由皮膚的外胚層分化形成，此外還形成了皮脂腺、汗腺和指甲等附屬物結構[5]。對于綿羊來說，除了提供保護，羊毛也有感官功能，在皮膚水平上延伸觸覺的發生[10]。羊毛是一種重要的動物產品，是紡織工業的原材料。羊毛的質量取決于它的纖維直徑(細度)、卷曲度、長度、顏色等。其中，纖維直徑是決定羊毛品質和價格的最重要因素。作為羊毛生長的直接器官，毛囊對生產優質羊毛起著至關重要的作用，而且毛囊能夠在不同季節改變類型和密度[11]。羊毛次級毛囊的生長周期和復雜的結構影響羊毛的生長發育和羊毛品質。

許多研究人員對毛囊形態學進行了研究，許竟武等通過組織切片證實湖羊在胎齡66 d時體側部出現初級毛囊原始體，到胎齡95 d時發育完全，此時次級毛囊原始體才開始出現，到132 d 時初級毛囊和次級毛囊均已發育完全[12]。灘羊在45～50 d胎兒期的時候頭部毛囊原始體開始出現，60 d時毛囊原始體開始發展到全身，到105 d時毛纖維已生長出體外[13]。蘇博美利奴羊皮膚初級毛囊約在胚胎 50～55 d 開始形成，胎齡 65～75 d 是初級毛囊形成的重要時期，胎齡 80～85 d 是次級毛囊形成期，胎齡 105～135 d 是次級毛囊大量再分化時期[14]。

Gao等通過對絨山羊毛囊形態學變化表明，初級毛囊在胎齡60 d開始發育，到胎齡120 d成熟，而在胎齡120 d鑒定出次級毛囊的分化，直到出生后羊毛形成[15]。張燕軍等通過觀察內蒙古阿爾巴斯絨山羊胚胎皮膚組織切片，發現絨山羊的毛囊由連接組織鞘(CTS)、外根鞘(ORS)、內根鞘(IRS)、毛球和毛干等組成，在胎齡55～65 d時，毛芽開始形成，胎齡135 d時，大多數初級毛囊和一部分次級毛囊分支發育基本成熟[16]。阿拉善絨山羊胎兒皮膚石蠟切片觀察表明，胎兒期45 d時初級毛囊發生，75 d時次級毛囊發生，同時皮脂腺和汗腺等附屬物出現，豎毛肌在90 d出現，初級毛囊在胎兒135 d時發育完成，次級毛囊到出生后6月齡發育完成。林吉茂等運用HE和Masson染色法以及透射電鏡觀察不同發育時期的山羊胎兒皮膚組織切片，結果顯示，胎齡8～9周表皮開始發育，10周胎齡真皮層開始出現，11周胎齡原始毛囊出現，12～13周胎齡表皮細胞出現角質層、透明層及顆粒層的分化，汗腺開始出現；14～15周胎齡毛球上皮細胞開始分化為外根鞘、內根鞘和毛發的前體，在毛囊旁可見附屬物皮脂腺；16～17周胎齡毛開始形成，并隨著發育逐漸長出體表；18周胎齡皮膚結構逐漸趨于成熟[17]。以上研究結果說明，綿羊的初級毛囊原始體在胎齡45～66 d出現，胎齡 65～75 d是初級毛囊形成期，胎齡 80～95 d 是次級毛囊形成期，胎齡 105～135 d 是次級毛囊再分化時期。

山羊的初級毛囊原始體在胎齡45～65 d出現，胎齡60～75 d是初級毛囊形成期，胎齡75～135 d到是次級毛囊發育期，胎齡120 d到出生是次級毛囊再分化時期。可見，綿羊和山羊由于品種不同，毛囊發育節點差異較大。

本研究通過制作中國美利奴羊(新疆軍墾型)胎兒期45～145 d皮膚毛囊不同發育時期的石蠟切片，分析皮膚毛囊發育的組織形態學特征，探究毛囊的發生及發育的細微過程。結果表明，皮膚結構在45～55 d逐漸發育完成，形成表皮層、真皮層、皮下結締組織3層。

在胎兒發育過程中，毛纖維發育首先在皮膚的生發層出現一個結點，周圍的血管為其輸送血液和營養，細胞開始迅速分裂增殖，在65 d出現毛囊原始體，隨著細胞大量增殖，毛囊原始體的部位出現囊泡，然后開始向真皮層伸入生長，初級毛囊開始發育。到胎齡85 d時，毛囊從真皮層一直延伸到皮下結締組織，次級毛囊開始發育。胎齡105 d時，次級毛囊開始分化，出現再分化次級毛囊。毛球細胞持續增殖，管狀邊沿的細胞不斷聚集而形成毛鞘，中間的則形成毛根，并開始角質化。毛鞘內的細胞急劇增殖，毛原錐體從毛鞘生長層連續的向上生長，而逐漸角質化。角質化后細胞形成的各種形狀細胞，形成毛纖維。次生毛囊此時以形成了許多分支。新生的角質化細胞不斷生長，新長成的羊毛纖維開始向上生長，加之有規律的毛囊周期性運動，毛纖維最后穿過表皮伸出體外，即形成了毛管。

115～145 d毛囊的橫切面可以看出皮脂腺和汗腺都可以與中央毛囊群(PCX)相關聯。盡管一些毛囊兩個形成一對或保留為孤立的毛囊。因此，最早發育的次級毛囊出現在離初級毛囊最遠的毛囊群周圍，而最近的次級毛囊往往出現在中央初級毛囊之間。

本研究表明，中國美利奴羊(新疆軍墾型)的毛囊原始體、初級毛囊、次級毛囊和再分化次級毛囊發育時間處于已報道的毛囊發育時間范圍，而具體的發育時間差異可能是由于不同品種或者相同品種不同品系，以及生長環境、營養水平等原因導致結果不同。

次級毛囊數量/初級毛囊數量(S/P)的比值是反映羊毛纖維直徑的重要指標。在細毛羊選育工作中，選擇S/P值大的個體，不但能夠使產毛量提高，還能夠增加羊毛長度、減小羊毛細度，有助于同時提高產毛量和羊毛品質。史雷等通過制作陜北白絨山羊皮膚組織切片，觀察皮膚毛囊形態特征，統計分析皮膚和毛囊的特征參數，S/P值與產絨量呈極顯著正相關，與絨細度呈顯著負相關，與絨長度呈顯著正相關；次級毛球寬度與產絨量、絨長度呈極顯著正相關[18]。澳大利亞美利奴羊的S/P高于中國超細毛羊(甘肅型)，然而中國超細毛羊(甘肅型) S/P值高于甘肅高山細毛羊[19]。中國超細毛羊(甘肅型)初級毛囊密度在胎齡87 d 時最大，隨著胎齡的增加而逐漸減小；次級毛囊密度在胎齡87～117 d 時逐漸增加,在117 d時為(232.8±12.44)個/mm2達到最大值，然后逐漸減小，從138 d至出生時基本穩定；S/P 比值在87～126 d 時逐漸增大,在126 d時達到最大值9.96之后開始減小，到出生時基本穩定。本研究中S/P值隨著胎齡的增加而逐漸增大，在135 d達到最大值，隨后在145 d時出現一個下降。

綜上所述，不同品種、同一品種不同品系、不同飼養條件、飼養管理、飼草料組成是造成的初級毛囊、次級毛囊和再分化次級毛囊發育時間，以及S/P值出現差異的原因。在細毛羊育種中，S/P值可以作為細毛羊選種工作中的一個重要性狀指標，注重皮膚毛囊性狀參數與產毛性狀參數的相關性分析。

4 結 論

通過對中國美利奴羊(新疆軍墾型)胎兒11個發育時期皮膚毛囊組織結構和形態學觀察，胎齡 55 d時皮膚已經形成了完整的結構，毛囊原始體于65 d逐漸形成，初級毛囊開始發生的時期；胎齡85 d 次級毛囊開始發生。胎齡 105 d 時在原始次級毛囊開始再分化出次級毛囊。初級毛囊密度隨著胎齡的增長而減小，次級毛囊密度隨著胎齡的增長而增大。胎兒期85～145 d的S/P值隨著胎齡的增加而逐漸增大。