一例草魚肌肉出血病的病原學分析

張 超

(重慶三峽職業學院，重慶 萬州 404155)

【研究意義】草魚(Ctenopharyngodonidellus)是“四大家魚”之一，具有肉味鮮美、營養價值高、飼料來源廣泛、市場價格穩定等特點，深受養殖戶和水產消費者的歡迎[1-2]。草魚是中國養殖產量最高、養殖范圍最廣的養殖品種，據《2019中國漁業統計年鑒》，2018年草魚的養殖產量達到550.43萬噸[3]。隨著集約化養殖水平的提高，各種病害頻繁發生，嚴重影響了草魚產業的健康發展，病害已經成為關系草魚養殖成敗的瓶頸。因此，分離鑒定病原并采取有效的防治顯得尤為重要。2019年4月上旬，重慶萬州某養殖場出現草魚死亡病例，流行病學特征和臨床癥狀與已報道的草魚的病害差異較大[4]，亟需開展系統的病原分離鑒定。【前人研究進展】對草魚為害較大的常見病為草魚出血病、細菌性爛鰓病、赤皮病、腸炎和細菌性敗血癥[4-5]。僅有草魚出血病能引起肌肉出血癥狀，但是，本文病例的流行病學特征和其他臨床癥狀與草魚出血病不符[4-5]。魯氏耶爾森菌(Yersiniaruckeri)是冷水性鮭科魚類的常見致病菌，典型癥狀為口腔出血和腸炎。該菌對大部分養殖的鮭鱒魚類都具感染性，并且能引起溫水性鯉科鰱、鳙魚發病[6]，但未見有侵染草魚的病例報道。【本研究切入點】該病發病急，3日累計死亡率達10 %。典型癥狀表現為口腔點狀出血、肌肉出血、腸外壁點狀出血、鰾出血，脾臟呈醬紫色。發病日平均氣溫為22 ℃，病魚平均規格115 g，3日內死亡量從開始的2～3尾增加到200多尾，病程持續1周，累積死亡率30 %左右，流行病學、臨床癥狀與已報道的草魚其他疾病存在明顯差異。【擬解決的關鍵問題】對重慶萬州某養殖場患肌肉出血癥的草魚進行病原菌分離鑒定和藥敏試驗，闡明發病原因，為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病草魚取自重慶市萬州區某養殖場，健康草魚購自當地水產品市場，規格大致與發病魚相同，暫養7 d后，隨機挑選進行回歸感染試驗。TSA培養基、革蘭氏染色液、藥敏檢測試劑盒、細菌微量生化鑒定管均購于杭州天和微生物試劑有限公司；RNA提取試劑盒、細菌基因組DNA 提取試劑盒、DNA回收試劑盒和DNA Marker購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 草魚呼腸孤病毒檢測

具體操作方法參考曾偉偉等[5]草魚呼腸孤病毒三重PCR檢測。

1.3 細菌分離與純化

將患病魚體表面用75 %酒精消毒，無菌操作取腦、肝、脾、腎劃線接種于TSA瓊脂平板上。培養基倒置于28 ℃恒溫培養箱中培養24～48 h[6]。選擇菌量較多、形態顏色一致的菌落，挑取單個菌落進一步劃線培養[6]。純化后的菌株轉移到TSA瓊脂固體斜面培養基上，置4 ℃冰箱保存備用[6]。革蘭氏染色參照文獻[7]的方法進行，光學顯微鏡下觀察細菌形態。

1.4 細菌生理生化試驗

參照細菌生化微量鑒定管說明書和《常見細菌系統鑒定手冊》[7]對病原進行鑒定。

1.5 細菌16S rDNA基因序列分析

使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取待檢菌株的DNA。16S rDNA基因PCR擴增引物參照分支桿菌[8]，反應條件略有改動。正向引物為：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3′；反向引物為：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′。PCR反應體系總量為50 μl，具體組成為：10×PCR緩沖液5 μl，MgCl2(25 mmol/L)5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.8 μl，正向引物和反向引物(20 μmol/L)各0.5 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/μl)1.2 μl，DNA模板5 μl，用無菌雙蒸水補足。PCR反應條件為：94 ℃預變性10 min，接下來94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環，72 ℃ 10 min。PCR產物用1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，膠回收后克隆到T載體上，送至上海生物工程有限公司進行測序。用NCBI-Blast進行在線序列比對，用ClustalX 1.81進行多重序列匹配和聚類分析，用Mega 4.0構建系統發育進化樹。

1.6 回歸感染試驗

將市場上購買的健康草魚分成兩組，每組20尾，調整菌懸液濃度為4×107cfu/mL，攻毒組每尾胸鰭基部注射0.2 mL菌液，對照組注射0.2 mL的生理鹽水。將試驗魚放置于水溫為22～25 ℃的養殖箱中，每天觀察并記錄魚的發病和死亡情況，持續時間為2周。同時對瀕臨死亡或已死亡的魚進行剖檢和病原菌的再次分離鑒定。

1.7 藥敏試驗

藥敏試驗采用紙片擴散法。取濃度為1.5×107cfu/mL的菌液0.2 mL均勻涂布于TSA瓊脂培養基平板上，28 ℃恒溫培養箱中倒置培養24 h后觀察并記錄抑菌圈的直徑，敏感性判定參照試劑盒說明書。

2 結果與分析

2.1 發病草魚特點及臨床癥狀

氣溫驟然升高后發病，發病日平均氣溫22 ℃，病魚平均規格115 g，3 d內死亡量從開始的2～3尾增加到200多尾，病程持續1周，累計死亡率30 %左右。病魚癥狀：運動能力差、體色異常、肌肉出血、鰭條基部出血、口腔廣泛性點狀出血，剖檢可見脾臟淤血腫大，呈醬紫色，腎臟和肝臟充血腫大，腸壁點狀出血，鰾出血(圖1)。

2.2 發病草魚呼腸孤病毒檢測

采用3種不同基因型的草魚呼腸弧病毒引物進行PCR檢測，結果均為陰性。草魚出血病的流行水溫為27～30 ℃，“紅肌肉型”多發于5～10 cm的草魚魚種，結合草魚呼腸孤病毒的流行病學和該病例的發病特點，可以排除草魚呼腸孤病毒感染。

A為肌肉出血、鰾出血；B為口腔點狀出血A. Muscle and bladder bleeding, B.Pointed oral bleeding圖1 病魚臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of diseased fish

2.3 病原分離株的形態特征

病原分離株的菌落形狀為圓形，表面光滑，邊緣平滑無凹凸，直徑大小約為1 mm，白色略透明。革蘭氏染色陰性，短狀桿，兩端呈圓狀，個別菌體相互連接成細絲狀(圖2)。

圖2 病原分離株的革蘭氏染色(×100)Fig.2 Gram staining of the isolate(×100)

2.4 病原分離株的生理生化特征

分離菌株在溫度18～36 ℃均能生長，最適宜生長溫度為24～31 ℃；在pH值4～10均能生長，最適生長的pH值范圍為5～8。細菌有運動性，硫化氫反應、V-P反應陰性，能發酵葡萄糖、果糖、麥芽糖。具體生理生化特征見表1，對照株參照范方玲等[9]。

表1 分離菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the isolate

2.5 病原分離株的16S rDNA基因序列分析

引物擴增分離株的16S rDNA，獲得長度為1509 bp的特異性條帶(圖3)。通過NCBI-Blast同源性比對，發現病原菌的16S rDNA基因與魯氏耶爾森菌的同源性達99 %。從GenBank數據庫中下載相關序列，用ClustalX 1.81對序列進行校正，采用Mega 4.0構建系統發育樹，結果顯示病原菌與魯氏耶爾森菌聚為一支(圖4)。

2.6 健康草魚人工感染試驗

試驗組草魚在人工感染2 d后，出現活力下降，游動無力現象，鰭條基部開始有出血點呈現，口腔有斑點狀出血點，7 d內發病草魚占攻毒草魚總數的70 %，而注射無菌生理鹽水的對照組未見異常(表2)。

表2 人工感染后草魚發病和死亡結果Table 2 Data about disease and death of grass carp after artificial infection

M為2000 DNA Ladder;1為分離株16S rDNAM=2000 DNA Ladder;1=16S rDNA of the isolate圖3 病原分離株的16S rDNA基因序列擴增電泳圖Fig.3 Electrophoresis of 16S rDNA of the isolate after being amplified by PCR

LY1904為分離株，細菌種名后的序號為 GenBank 登錄號LY1904 is the isolate. Serial numbers after the species name are GenBank accession number圖4 病原分離株的16S rDNA基因序列系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the isolate based on 16S rDNA sequence

剖檢可見腸道斑點狀出血，鰾表面出血，與自然發病的草魚癥狀相似。再次分離到的菌株與原代菌株形態，生理生化性質和16S rDNA序列分析一致，表明分離株為該病例的致病病原。

2.7 病原分離株的藥敏試驗

分離菌株對36種抗菌藥的敏感性表現：對青霉素G、苯唑西林、利福平、萬古霉素、克拉霉素、紅霉素、頭孢他啶、麥迪霉素、痢特靈存在耐藥性，對氨芐西林、恩諾沙星、氟苯尼考等19種抗菌藥敏感(表3)。

表3 病原分離株的藥敏試驗結果Table 3 Antibiotic sensitivity test of the isolate

3 討 論

該草魚病例的典型癥狀為肌肉出血，發病水溫為17～22 ℃，疑似肌肉出血型草魚出血病，但是流行病學特點與草魚出血病不符[10]，通過草魚呼腸孤病毒三重PCR檢測也排除了病毒感染的可能，亦未見明顯的寄生蟲侵襲。從病魚的腦、肝、腎和脾中均分離到單一的菌落特征相同的革蘭氏陰性細菌，其形態和理化特征均與魯氏耶爾森菌較為符合[9, 11-13]。分離菌株經16S rDNA PCR擴增和序列測定，得到的片段大小為1509 bp，通過BLAST比對，與魯氏耶爾森菌的同源性最高，達99 %，人工感染試驗與自然發病的癥狀一致，表明魯氏耶爾森菌為該病例的致病病原。

魯氏耶爾森菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)耶爾森氏菌屬(Yersinia)，冷水性鮭鱒魚類為易感品種，典型癥狀為腸炎和“紅嘴”，常引起重大經濟損失[14-17]。該病菌20世紀50年代首次分離自美國愛達荷州的養殖虹鱒(Oncorhynchusmykiss)，當前主要流行區域為加拿大、歐洲、美國南部、中東、中國、印度和澳大利亞，侵染魚類包括鮭鱒科魚類、鯉魚(Cyprinuscarpio)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)、鱘魚(Acipenseriformes)、斑點叉尾鮰(Ictalunespunctatus)等，已成為養殖魚類主要病原菌之一[13, 18-21]。本研究首次從中國的養殖草魚病例中分離到一株魯氏耶爾森菌，發病癥狀和鰱、鳙較為相似，呈現典型的敗血癥癥狀，早期資料認為魯氏耶爾森菌是淡水魚類細菌性敗血癥的主要病原[15]，本文的研究數據也證實了這一點。該病例還表現為肌肉出血，與草魚出血病癥狀較為相似，典型區別為前者肌肉呈暗紅色，后者呈鮮紅色，臨床上應結合流行病學特征進行鑒別診斷[10, 15]。

本研究首次從中國的養殖草魚中分離到致病魯氏耶爾森菌，分離株對36種抗菌藥的敏感性結果為該病的臨床防治提供了參考。該菌對恩諾沙星、氟苯尼考、環丙沙星敏感，這與范方玲等[9]和方蘋等[11]

的報道相同，與斑點叉尾鮰魯氏耶爾森菌[11]對卡那霉素的敏感性有很大的差異，這種差異可能是由菌株自身引起，也可能是養殖過程中使用可誘導菌株產生耐藥性的藥物所致[22-25]。總的來說，對魯氏耶爾森菌病的治療應采用恩諾沙星和氟苯尼考等水產常用抗菌藥，筆者臨床采用氟苯尼考對該病例進行治療，獲得了較好的效果。該病發生的起始因素是水質惡化，生產中應定期對養殖水體進行養護，同時嚴格執行標準化飼養管理，才能從根本上預防該病的發生。

4 結 論

通過系統的病原分離鑒定，確定引起該例草魚肌肉出血病的病原為魯氏耶爾森菌。魯氏耶爾森菌是冷水魚的主要致病菌，本研究首次從中國的養殖草魚中分離到致病魯氏耶爾森菌，該菌對青霉素G、苯唑西林、利福平、萬古霉素、克拉霉素、紅霉素、頭孢他啶、麥迪霉素、痢特靈存在耐藥性，對氨芐西林、恩諾沙星、氟苯尼考等19種抗菌藥敏感，可選用恩諾沙星、氟苯尼考等水產類常用抗菌藥進行防治。