小麥抗條銹基因 Yr10的抗病通路研究

高花雨，何 琪，賈勁松，丁 焱，王亞茹，王曉靜，康振生

(1.西北農林科技大學植物保護學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.西北農林科技大學生命科學學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100；3.西北農林科技大學創新實驗學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

小麥條銹病是由條形柄銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.triticii)引起的一種世界性氣傳真菌病害。該病害發生歷史久遠，危害范圍廣，病原菌可隨氣流遠距離傳播，且極易發生變異，也是我國小麥危害最為嚴重的一類病害。該病害多次在全國大流行，造成嚴重的產量和經濟損失，直接影響我國糧食安全[1]。利用抗病品種是防治小麥條銹病最根本和有效的措施，但條銹菌毒性變異頻繁，已導致我國90%以上的小麥生產品種“喪失”抗銹性，對小麥生產和糧食安全構成極大威脅[1]。因此，加強小麥抗銹機制研究，合理利用小麥抗銹性，對延緩病菌變異和持續控制條銹病具有重要的意義。

經典的基因對基因學說闡明了植物中的抗病基因(R)在病原菌中都有互作的無毒基因(Avr)[2]。在植物中，目前已經克隆的植物抗病基因中，核苷酸結合位點-亮氨酸富集重復蛋白(nucleotide-binding site,leucine-rich repeat receptors,NBS-LRR)抗病基因占大多數，是一類非常重要的抗病基因，這類抗病基因編碼的蛋白作為受體與病原菌Avr基因編碼的蛋白直接或間接互作會引發一系列反應，包括活性氧的迸發、離子流、蛋白質的磷酸化和水楊酸(SA)含量的變化等[3-4]，最終激活防御反應信號途徑，產生過敏性壞死反應(hypersensitive response,HR)[5]。在NBS-LRR介導的信號通路中，植物激素SA作為信號分子誘導病程相關蛋白(PR)基因的表達上調，產生HR和整個植株廣譜持久的系統獲得抗性(systemic acquired resistance，SAR)[5-7]?？共⊥分泻芏嗫共∠嚓P基因也直接參與R基因介導的抗病通路，如RAR1、SGT1和HSP90基因編碼的蛋白已經被證明在NBS-LRR類R基因介導的SA抗病信號通路中起作用[8-9]。研究這些基因在小麥防御條銹菌過程中的表達和功能對闡明R基因介導的防御信號通路有重要意義[10]。

抗病基因的結構復雜多樣，其抗病通路也不同。目前已經克隆的抗條銹病基因中，Yr5和Yr7是NBS-LRR類型的抗病基因，在N-端有一個保守的含鋅指結構(zinc-finger)的BED結構域,該結構域通過結合轉錄因子WKRY來激活防御反應[11]。已有研究表明，WRKY70基因在SA信號通路中調節基因的表達[12]。Yr15是一個廣譜且具有全生育期抗性的基因，其編碼一個含有串聯激酶結構域的蛋白WTK1(wheat tandem kinase 1)，該結構域與植物抗病防御相關。Yr18(Lr34/Sr57/Pm38)編碼的蛋白是一個ABC轉運子(ATP-binding cassette，ABC)，目前證明其作用底物是脫落酸(ABA)，通過ABA影響病原菌的生長，達到抗病的目的[13]。Yr36基因編碼的蛋白是一個含START結構域的激酶(Kinase-START)[14]，該激酶可以通過跨膜運輸進入到葉綠體，與類囊體抗壞血酸過氧化物酶結合使其磷酸化，干擾其分解過氧化氫，造成活性氧的積累，從而加速細胞死亡，有效地限制了條銹菌在小麥葉片組織內增殖[15]。Tada等[3]的研究結果表明，在寄主植物防御病原真菌引起的過敏反應中，伴隨有大量的活性氧產生，并且這些活性氧的產生可能和過敏反應的起始以及發展有密切的關系。但目前對抗病基因的通路研究還非常局限，對抗病防御反應的激活和抗病信號的傳導仍需深入的研究。

小麥抗條銹病基因Yr10定位于小麥1B染色體上，具有全生育期抗性的特點[16]。根據早期獲得的Yr10的分子標記，Liu等[17]通過轉基因和病毒介導的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)等技術，證明該基因抗條銹病，其編碼的蛋白屬于NBS-LRR類受體蛋白。

長期以來的研究和生產實踐證明，合理利用抗病基因，培育和推廣高效、穩定、廣譜、持久抗病品種是防治小麥條銹病最經濟、安全和有效的方法，但單一抗病品種多年使用，容易導致品種抗性喪失。因此，研究抗病基因的抗病通路，可以為傳統育種提供新的思路和策略。本研究通過研究抗病基因Yr10介導的抗病通路中植株活性氧積累和侵染部位細胞壞死情況，分析內源激素SA的積累量變化和抗病相關基因的表達，以期為解析Yr10的抗病通路奠定基礎，從而為將來合理利用抗病資源、培育持久高效抗病小麥材料提供理論 依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥材料為AvocetS (以下簡寫為AvS)及其近等基因系AvSYr10NIL (near-isogenic lines，以下簡寫為AvS+Yr10)，條銹菌生理小種為CYR31，均由西北農林科技大學旱區作物逆境生物學國家重點實驗室植物免疫研究室提供。

1.2 供試材料中活性氧含量的測定

待AvS和AvS+Yr10小麥材料長至一葉一心時期，接種條銹菌CYR31，分別在接菌后0、12、24、48、72、96和120 h后剪取幼苗葉片，每個樣品3個生物學重復。利用PBS緩沖液對樣品進行研磨。按照植物活性氧酶聯免疫分析試劑盒方法(上海滬鼎生物科技有限公司進口分裝)進行H2O2含量的測定。

1.3 供試材料的細胞組織學觀察

分別在接種條銹菌48和72 h后剪取葉片，將葉片剪成1～2 cm 小段，置于乙醇∶冰醋酸=1∶1的固定液中脫色固定，定期更換固定液，待葉片綠色脫凈，用飽和水合氯醛溶液處理6 h后，保存于30%甘油中，Olympus BX-51 微分干涉顯微鏡觀察細胞的壞死狀況。

1.4 供試材料中內源SA含量的測定

樣品的取樣方法同1.2，樣品稱取鮮重后用液氮速凍，用破碎儀破碎樣品。加浸提液(甲醇∶水∶冰醋酸=89∶10∶1)渦旋樣品后，12 000 r·min-1室溫離心，轉移上清液到新的離心管中。重復操作2～3次。獲得的樣品加水稀釋至甲醇濃度為50%，超低溫冰箱冷凍后放置冷凍干燥儀中過夜。干燥后的樣品用色譜級甲醇溶解后，用 0.22 μm有機系過濾膜過濾至上樣瓶中。利用西北農林科技大學生命學院實驗平臺的質譜儀器LC-30A+TripleTOF5600+(AB SCIEX,Singapore)測定SA的含量。

1.5 QRT-PCR 分析

AvS和AvS+Yr10小麥樣品的取樣方法同1.2，采用Biozol法提取各時間點采集的小麥樣品RNA，用反轉錄試劑盒(Thermo,美國)將RNA反轉錄為cDNA,利用Primer Premier 5.0軟件設計基因定量分析引物(表1)。其中，以肌動蛋白actin基因作為內參基因。以反轉錄的各時間點cDNA為模板，利用Bio-Rad Real-time PCR儀分別檢測TaRAR1、TaHSP90、TaSGT1和PR1基因的表達量。PCR擴增體系為20 μL，包括cDNA 2 μL，SYBR Green mix 1μL,上下游引物各1 μL,ddH2O補齊到20 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性10 min；然后95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，40個循環。收集溶解曲線程序：60 ℃升至95 ℃時，PCR儀每隔1 ℃檢測一次信號。用2-ΔΔCt法[18]計算基因的相對表達量，每個處理 3次生物學重復。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the study

2 結果與分析

2.1 供試小麥材料接種條銹菌后活性氧和SA積累量的變化

從表2可以看出，SA和活性氧的積累量都存在兩個高峰，但高峰出現的時間點不同。接種條銹菌后，AvS和AvS+Yr10小麥材料葉片中的H2O2含量均在接菌后24和96 h有迸發現象，在接菌72 h后H2O2含量最低，在96 h后又有所降低。AvS小麥材料的內源SA含量在接菌后12和96 h出現峰值，在接菌48 h含量最低，72 h有所回升，到120 h又恢復至接菌前水平；AvS+Yr10小麥材料的內源SA含量在接菌后12和 72 h出現峰值，在接菌后24 h內源SA含量最低， 48 h又有所升高，到120 h又恢復到接菌前的水平。總體來看，AvS小麥材料的H2O2和內源SA含量低于AvS+Yr10小麥材料。

表2 接種條銹菌后AvS和AvS+ Yr10葉片中H2O2和內源SA含量的變化Table 2 H2O2 accumulation and endogenous SA concentration in AvS and AvS+ Yr10 leaves after inoculation with stripe rust

2.2 供試小麥材料接種條銹菌后細胞壞死狀況

接菌后48和72 h，通過組織學觀察AvS和AvS+Yr10小麥材料中條銹菌在侵染位點葉肉細胞的壞死產生情況，結果(圖1)發現，在接菌后48和72 h，在微分干涉顯微鏡明場下均可觀察到形成氣孔下囊(SV)的侵染點(圖1a、圖1c、圖1e和圖1g)。活性氧的產生通常會引起侵染位點附近的葉肉細胞壞死，在接菌后48和72 h，在熒光顯微鏡下均可觀察到AvS+Yr10小麥材料葉肉細胞產生黃色的自發熒光(圖1d和1h)，說明該細胞發生了HR反應，并且72 h的自發熒光面積比48 h的自發熒光面積大，表明壞死面積隨侵染時間的推移而增大(圖1d和1h)。而接菌后48和72 h，AvS小麥材料中沒有自發熒光產生(圖1b和1f)。

2.3 供試小麥材料接種條銹菌后 PR1基因的表達分析

從圖2可以看出，PR1基因的表達量在AvS和AvS+Yr10小麥材料中趨勢一致，均呈先升高后降低的趨勢。但在接菌后不同時間點，PR1基因的表達量在含有Yr10抗病基因的小麥體內積累較多，在病原菌侵染48和72 h時，PR1基因的表達量在AvS和AvS+Yr10小麥材料間的差異達到了極顯著水平，說明PR1基因在Yr10的抗病信號通路中發揮著重要作用。

2.4 抗病相關基因的表達和功能分析

利用實時定量分析抗病相關基因RAR1、SGT1和HSP90在AvS和AvS+Yr10小麥材料中接種條銹菌后的表達水平，結果(表3)發現，接菌后不同時間三個基因的表達趨勢基本一致。在0～24 h均表現為上調表達，并且SGT1和HSP90基因均在AvS+Yr10材料中顯著上調表達。在接菌后48 h，AvS+Yr10材料中三個基因的表達量均顯著高于AvS材料。說明在Yr10介導的抗病通路中三個基因都參與了小麥對條銹菌的防御反應。

表3 TaRAR1、 TaSGT1和 TaHSP90在小麥材料AvS和AvS+ Yr10接菌后的相對表達量Table 3 Relative expression of TaRAR1, TaSGT1 and TaHSP90 in wheat material AvS and AvS+ Yr10after inoclulation of stripe rust

為了進一步驗證三個基因在Yr10介導的抗病通路中的功能，對三個基因分別進行病毒誘導的基因沉默實驗。摩擦接毒后12 d，接種BSMV:PDS病毒植株的第4葉出現明顯光漂白現象，表明病毒RNA介導的基因沉默已經發生(圖3A)；沉默后的植株接種條銹菌CYR31，在接種后15 d進行表型觀察，發現在不含Yr10抗病基因的AvS材料中，不做接毒處理的對照組Mock和只接病毒的對照組BSMV:00與實驗組BSMV:HSP90和BSMV:RAR1的葉片均產孢，并且產孢數量無明顯差異(圖3B)。而在含有Yr10抗病基因的小麥材料AvS+Yr10中，BSMV:HSP90和BSMV:RAR1實驗組與對照組BSMV:00相比，過敏性壞死反應程度降低(圖3A)。結果表明，TaRAR1和TaHSP90在Yr10抗病基因引起的過敏性壞死反應中起作用。TaSGT1由于沉默后嚴重影響植物的發育，未展示結果。

為確定TaRAR1和TaHSP90基因的沉默效率，通過實時定量檢測沉默后葉片中這2個基因的表達量。在接種BSMV:PDS病毒植株出現光漂白現象時，分別對接種BSMV:HSP90和BSMV:RAR1的沉默植株進行取樣，并測定TaHSP90和TaRAR1基因的表達量。與接種空病毒BSMV:00對照組相比，親和組合AvS/CYR31中TaHSP90和TaRAR1基因的沉默效率分別為67%和83%，非親和組合AvS+Yr10/CYR31中TaHSP90和TaRAR1基因的沉默效率分別為66%和91%，表明兩個基因都被顯著抑制(表4)。

表4 TaHSP90和 TaRAR1基因沉默的小麥材料中的相對表達量Table 4 Relative expression of TaHSP90 and TaRAR1 in gene silenced wheat

3 討 論

活性氧在植物的防御反應中扮演一個重要的角色[19-20]。寄主抗病基因R識別病原菌Avr基因編碼的蛋白后會快速迸發活性氧，然后誘導侵染部位發生HR反應及抗病相關基因的表達[5]。本研究對小麥材料AvS和含有Yr10抗病基因的近等基因系AvS+Yr10接種條銹菌小種CYR31分別組成親和與非親和體系。通過酶聯免疫法和組織學檢測法研究非親和體系中活性氧積累和細胞的壞死情況。在非親和體系中，活性氧在接菌后24和96 h出現迸發現象。伴隨活性氧的產生，侵染位點的組織細胞壞死。說明在Yr10介導的植物防御反應中活性氧的產生作為早期事件，細胞內活性氧的升高抑制了條銹菌的菌絲發育和菌落形成，并在侵染點的寄主細胞發生典型的過敏性細胞壞死，完成植物防御反應。這些變化與條銹菌和其他抗病品種的非親和組合所表現出的特征基本一致[19,21]。

R基因介導的抗性觸發了信號轉導而導致局部細胞程序性死亡(PCD)和SAR，PCD即HR反應[22-23]。HR發生在感染部位可以限制活體寄生菌在內的病原菌在寄主體內的擴展。通過SA介導的信號傳導途徑，SAR經常與PR基因一起被誘導產生整株或廣譜植物抗性[24-25]。在NBS-LRR介導的信號通路中，SA在植物防御反應過程中具有重要作用[4]。本研究結果表明，含抗條銹病基因Yr10的小麥材料AvS+Yr10中內源SA含量在接菌后12和72 h出現高峰，兩個高峰出現的時間較活性氧迸發的時間較早。而在SA含量產生高峰前，H2O2含量雖未到達頂峰，但出現了快速的積累，其誘導了SA的快速積累并達至高峰。反之，SA的積累又加速了H2O2的積累，使得活性氧含量的第一個高峰出現。說明在非親和體系中，SA信號作為一個更早的信號，與活性氧迸發之間存在一定的相關性，這種相關性形成一種微循環，互相促進植物防御反應的發生，最終使植物產生獲得性免疫反應。PR基因的表達量也隨SA的積累和活性氧的產生逐漸升高，在接菌后48和72 h親和與非親和組合出現顯著差異。Wang等[9]研究表明，在水源11組成的非親和體系中，內源SA和H2O2含量增加，小麥的抗性增強，這與本研究中Yr10抗病通路中的SA和活性氧含量的變化一致。在小麥抗病基因Yr10與Avr基因識別后，活性氧含量的升高引起SA信號的級聯轉導，誘發活性氧的迸發，進而引起下游PR蛋白的表達，導致HR反應和HR的發生。

在抗病通路中，HR反應是植物抗病基因和病原菌Avr基因編碼的蛋白相互作用的結果，在這個過程中抗病蛋白復合體的激活往往由其他抗病相關基因調控，在抗病中具有重要作用[8,23]。如RARl編碼的蛋白首次是從大麥抗白粉病基因Mla12介導的抗病信號途徑中分離的一個重要信號元件。RAR1通常與SGT1和HSP90相互作用形成蛋白復合體，促進抗病基因復合物的形成和激活，對完成下游PR1基因的表達起到重要作用。本研究發現，與AvS材料相比，AvS+Yr10材料中RAR1、HSP90和SGT1基因的表達量均在接菌后24 h顯著升高，并且基因沉默后能引起HR反應的降低。因此，在抗病通路中，SA激素、活性氧和抗病相關蛋白形成的復合體共同調節由抗病基因引起的寄主細胞壞死?；诒狙芯康某醪窖芯拷Y果，筆者提出Yr10介導的抗病通路模式為：在早期抗病基因R和病原菌的無毒基因Avr識別，抗病相關蛋白RAR1、HSP90和SGT1形成蛋白復合體通過某種方式維持抗病蛋白復合體的結構處于激活狀態，隨后SA信號分子的積累促進活性氧的迸發和HR反應，但其具體調節的分子機制還需要進一步研究。