懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白基因的克隆和序列分析

洪森榮,曾曉健,魏 杰,溫倩文,謝 微,楊玉琪,姚 夢,易奧情,于小姣,蔡 紅,陳榮華

(1.上饒師范學院生命科學學院,江西 上饒 334001；2.上饒市藥食同源植物資源保護與利用重點實驗室，江西 上饒 334001；3.上饒市薯芋類作物種質保存與利用重點實驗室，江西 上饒 334001；4.上饒農業技術創新研究院，江西 上饒 334001；5.上饒市紅日農業開發有限公司,江西 上饒 334700)

【研究意義】懷玉山高山馬鈴薯，俗名麻籽洋芋，營養全面，還原糖未檢出，非常適合三高人群輔助治療[1]。懷玉山高山馬鈴薯種植于海拔 500 m 以上高山環境，病害蟲較少，有利于生產無公害懷玉山高山馬鈴薯。2015年，中國啟動馬鈴薯主糧化戰略，在此背景下，發展懷玉山高山馬鈴薯產業是保障糧食安全、促進農民增收又一選擇[2]。【前人研究進展】馬鈴薯病毒病可引起種質退化、產量下降、品質變劣、商品性差，嚴重影響薯農的經濟效益[3]。煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus， TMV)是黑龍江馬鈴薯產區極易侵染的病毒，但江西馬鈴薯產區未檢出TMV[4]。研究表明，辣椒L基因控制TMV 抗性，引起細胞過敏性死亡[5]。另外，從杏毛頭鬼傘[6]、鮑菇[7]和榆黃蘑[8]中也篩選出抗煙草花葉病毒y3基因、xb68Ab蛋白和YP46-46蛋白，抗TMV活性較強，且煙草中抗TMV的N基因和 TMV 之間的互作以及N基因介導的抗病反應和信號傳導也已探明[9-10]。【本研究切入點】尹明華等[11]對懷玉山高山馬鈴薯進行了轉錄組分析，發現懷玉山高山馬鈴薯表達了抗TMV蛋白基因，這可能是TMV無法侵染懷玉山高山馬鈴薯的主要原因。【擬解決的關鍵問題】目前，關于馬鈴薯抗馬鈴薯Y病毒(PVY)基因已經克隆[12]，而關于馬鈴薯抗TMV蛋白基因的研究少見報道。本研究通過從構建的懷玉山馬鈴薯轉錄組數據庫中挑選抗TMV蛋白基因序列對其進行克隆，并對其進行生物信息學分析，為分析懷玉山馬鈴薯抗TMV蛋白基因保守結構域提供基礎資料，對進一步揭示懷玉山馬鈴薯抗TMV蛋白的生物學功能提供理論依據，也為深入分析其它植物的抗TMV蛋白結構與功能關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

懷玉山高山馬鈴薯試管苗由上饒師范學院生命科學學院植物組織培養室提供。

1.2 總 RNA 的提取和 cDNA 第一鏈的合成

用Trizol 試劑提取懷玉山高山馬鈴薯試管苗的總 RNA，提取步驟按說明書進行，使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的濃度和完整性。以提取獲得的 RNA為模版，按照 M-MLV cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書合成 cDNA 第一鏈。逆轉錄引物用 Oligo(dT) 18 Primer ：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具體步驟按說明書進行。

1.3 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白基因基因的克隆

利用懷玉山高山馬鈴薯試管苗轉錄組數據庫篩選出抗TMV蛋白基因的核心片段，運用 Primer Premier 5.0 設計基因特異性引物(F:ATGGCATCATCTTCTTCTTCTTTTG；R:CTATAATCCCGAGCTTGTGGG)。PCR擴增條件：95 ℃ 2 min；【95 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s】(35個循環)；72 ℃ 10 min。PCR 產物經 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶與 pMD19-T 載體連接并用熱激法轉化到感受態細胞E.coliDH5α， 經鑒定正確的陽性轉化子提取質粒送往上海生工進行測序。

1.4 生物信息學分析

按照彭波等[13]的方法對懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白進行氨基酸序列分析、理化性質分析、結構預測、功能分析。

2 結果與分析

2.1 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白一級結構分析

2.1.1 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白基因cDNA序列 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白基因cDNA總長度為4335 bp(圖1)，G+C 含量為38.22 %(圖2)。

2.1.2 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白氨基酸序列 Protparam預測顯示，懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白由1444個氨基酸組成(圖3)，分子量165 229.13 Da，等電點5.78，為親水性蛋白。各氨基酸的數目和比例為Ala (A,54，3.7 %)、Arg (R,62，4.3 %)、Asn (N,77，5.3 %)、Asp (D,88，6.1 %)、Cys (C,39，2.7 %)、Gln (Q,52，3.6 %)、Glu (E,112，7.8 %)、Gly (G,70，4.8 %)、His (H,40，2.8 %)、Ile (I,79，5.5 %)、Leu (L,211，14.6 %)、Lys (K,107，7.4 %)、Met (M,26，1.8 %)、Phe (F,64，4.4 %)、Pro (P,51，3.5 %)、Ser (S,145，10.0 %)、Thr (T,39，2.7 %)、Trp (W,18，1.2 %)、Tyr (Y,47，3.3 %)、Val (V,63，4.4 %)、Pyl (O,0，0.0 %)、Sec (U,0，0.0 %)。帶負電殘基總數(Asp+Glu)為200，正電荷殘基總數(Arg+Lys)為169。原子組成：碳(C) 7381，氫(H) 11612，氮(N)1964，氧(O) 2205，硫(S) 65；分子式：C7381H11612N1964O2205S65，原子總數：23 227。摩爾消光系數以M-1cm-1為單位，在水中測量的280 nm處，Abs 0.1 %(=1 g/L)1.037，假設所有對半胱氨酸殘基形成胱氨酸，外系數171405；Abs 0.1 %(=1 g/L)1.023，假設所有Cys殘基均減少，外部系數169030。所考慮序列的N端是M(Met)，估計半衰期為30 h(哺乳動物網織紅細胞，體外)，>20 h(酵母，體內)，>10 h(大腸桿菌，體內)。不穩定指數：失穩指數(II)計算為42.64，這將蛋白質歸類為不穩定的。脂肪指數：94.72，總平均親水性為-0.319。

2.1.3 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白親疏水性分析 從圖4可知，高峰值(正值)的區域表示疏水的區域，而負值的“低谷”區域是親水區域。疏水性結果分析表明，最大疏水值為2.5左右，說明該多肽該處的疏水性最強;親水峰最大值為-3左右，整個蛋白質表現出高度的親水性，說明該蛋白為親水性蛋白質。

2.2 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白二級結構和三級結構分析

懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白的二級結構(圖5)預測如下：GOR 預測顯示其二級結構由α-螺旋(Alphahelix，Hh，43.77 %)、β-片層(Extendedstrand，Ee，12.47 %)、無規則卷曲(Randomcoil，Cc，43.77 %) 構成(圖6)。從分布位點上來看，C端含無規則卷曲和β-片層，N端含β-片層和α-螺旋，且無規則卷曲、β-片層和α-螺旋則散布于整個蛋白質中。由于該蛋白質未搜索到同源蛋白，無法進行三級結構模擬。

2.3 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白亞細胞定位

采用 Psort在線軟件對懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白基因的表達部位進行預測(圖7)， 定位于細胞核中的數量為8，葉綠體中的數量為2，線粒體中的數量為2，細胞骨架中的數量為2，表明懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白主要存在細胞核中。

2.4 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白系統進化分析

從構建的進化樹(圖8)中可見，懷玉山高山馬鈴薯與S.tuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like isoform X1(類TMV抗性蛋白N亞型X1)、S.tuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like isoform X2(類TMV抗性蛋白N亞型X2)、S.tuberosum(馬鈴薯)N-like putative resistance gene 2(類N假定抗性基因2)、S.tuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like(類TMV抗性蛋白N)、S.lycopersicum(番茄)uncharacterized protein LOC101265700(非特征蛋白質 LOC101265700)、S.pennellii(野生種潘那利番茄)uncharacterized protein LOC107004430 isoform X1(非特征蛋白質 LOC107004430亞型X1)和S.pennellii(野生種潘那利番茄)uncharacterized protein LOC107004430 isoform X2(非特征蛋白質 LOC107004430亞型X2)在一個大分支下，這說明懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白在進化上與馬鈴薯、番茄和野生種潘那利番茄的親緣關系較近，尤其是與S.tuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like isoform X1(類TMV抗性蛋白N亞型X1)和S.tuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like isoform X2(類TMV抗性蛋白N亞型X2)在進化上具有最高的親緣關系。

3 討 論

煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)是煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的代表種，主要危害煙草、番茄和馬鈴薯等作物[14]。研究表明，TMV侵染存在地理隔離[15]。通過生化手段，絞股藍抗TMV蛋白(gynostemmin)被分離，分子量20～30 kD，等電點>8.0，N端含19個氨基酸殘基(DINFSLAGADGQTYNTFIA)，是一種新的I型核糖體失活蛋白[16]。辣椒L基因決定了辣椒對TMV的抗性，L基因屬于 CC-NBS-LRR(nucleotide-binding site-leucine-rich repeat)型R基因，具有NBS-LRR保守氨基酸序列[17]。煙草抗TMV基因N能編碼1個131.4 kDa的蛋白質，無跨膜區域和信號序列，主要存在于細胞質，其氨基末端結構域與果蠅Toll蛋白和哺乳動物白細胞介素-1受體(IL-1R)的胞質結構域相似，是核苷酸結合位點(NBS)和4個不完全富含亮氨酸重復序列(LRR)，N、Toll和IL-1R序列的相似性表明，N通過Toll-IL-1樣途徑介導快速基因誘導和TMV抗性[18-19]。TMV侵染煙草后，克隆到1個抗性基因CN，與抗煙草花葉病毒基因N同源，編碼區(3423 bp)與抗TMV基因N的核苷酸同源性分別為93.63 %，CN屬于TIR/NBS/LRR基因類[20]。煙草中還克隆到1個NH基因，編碼區為5.028堿基對(bp)與N基因同源性為82.6 %，屬于TIR/NSB/LRR基因類[21]。在本試驗中，懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白由1444個氨基酸組成，分子量165 229.13 Da，等電點5.78，在進化上與馬鈴薯、番茄和野生種潘那利番茄的親緣關系較近，尤其是與Solanumtuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like isoform X1(類TMV抗性蛋白N亞型X1)和Solanumtuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like isoform X2(類TMV抗性蛋白N亞型X2)在進化上具有最高的親緣關系。說明，懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白基因與絞股藍抗TMV蛋白不同，但與煙草抗TMV蛋白基因 N同源性較高。本研究克隆的懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白是懷玉山高山馬鈴薯首次報道的蛋白類活性物質。它的克隆有助于加強懷玉山高山馬鈴薯研究和開發的力度。

4 結 論

懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白具有典型抗TMV蛋白的結構特征，氨基酸序列及核酸序列與同源物種相似度高，在進化上高度保守，對進一步揭示該蛋白生物學功能具有重要意義。