基于轉錄組測序番茄抗南方根結線蟲相關基因的挖掘

陸秀紅，黃金玲，李紅芳，周 焰，劉志明

(廣西農業科學院植物保護研究所/廣西作物病蟲害生物學重點實驗室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】根結線蟲(Meloidogynespp.)可寄生于多種作物根系[1]，引起的番茄(Lycopersiconesculentum)根結線蟲病是番茄的重要病害之一，一般使番茄減產10 %～20 %，嚴重的地塊減產75 %以上[2]。生產上采用輪作和殺線劑等方法進行根結線蟲病防治雖取得一定的防治效果，但種植抗病品種才是防治該病最經濟有效和安全的方法。目前生產上使用的番茄栽培品種多為感病品種，少數抗病品種存在遺傳基礎狹窄及抗性單一等問題。挖掘新抗源及植物天然抗病基因，獲得具有抗根結線蟲病特性的轉基因番茄植株是一條有效的番茄育種途徑[3]。目前，番茄抗根結線蟲分子育種研究已取得一定進展，但應用最廣的抗病基因Mi-1存在熱不穩定性和自然界中存在Mi-1抗性小種等局限，限制了其廣泛應用[4]。因此，挖掘番茄與南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)侵染響應相關的關鍵抗性基因，對番茄抗性基因克隆及番茄抗病分子育種具有重要意義?！厩叭说难芯窟M展】國外育種專家早在20世紀40年代就開始番茄抗根結線蟲基因挖掘工作[5-6]，迄今已發現10個抗性基因(Mi-1、Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-7、Mi-8、Mi-9和Mi-HT)，這些基因均來源于野生番茄材料，其中從秘魯番茄(Solanumperuvianum)中克隆的Mi-1基因是目前番茄中唯一可利用且很有效的根結線蟲抗性基因，將其導入栽培番茄獲得了具有較強抗病性的轉基因番茄[7]。1998年，Milligan等[8]采用同位克隆方法首次克隆Mi-1基因，該基因編碼1257個氨基酸殘基，屬于NBS-LRR類抗性基因家族，其蛋白產物可能通過識別某些線蟲產物在線蟲侵染區域誘導發生過敏性反應而抑制線蟲取食。Kaloshian等[9]采用重組鑒定技術成功將Mi-1基因定位于番茄6號染色體短臂上的一段小區域。Kiewnick等[10]、Brito等[11]研究認為，Mi-1基因表現對溫度敏感，當土壤溫度超過28 ℃時對根結線蟲失去抗性；Mi-1基因能有效抵抗南方根結線蟲、爪哇根結線蟲(M.javanica)和花生根結線蟲(M.arenaria)3種常見根結線蟲，但不抗北方根結線蟲(M.hapla)和象耳豆根結線蟲(M.enterolobii)，因此影響其廣泛應用。轉錄組是指特定組織或細胞在某一功能狀態下轉錄出所有RNA的總和，轉錄組研究是一個發掘新功能基因的重要途徑[12-13]。李海燕等[14]對大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)侵染前后的抗病大豆品種進行轉錄組分析，篩選獲得1045個差異表達基因，其中參與苯丙胺類代謝相關的基因在接種線蟲后除1個基因下調外其余Unigenes均不同程度上調表達，而苯丙烷類代謝是植物抗病反應中重要的代謝途徑之一，可形成植保素、木質素和酚類化合物等次生代謝物。Das等[15]對南方根結線蟲誘導豇豆產生的取食位點進行轉錄組分析，發現活性氧(ROS)濃度的差異及毒素的誘導等在豇豆對南方根結線蟲的抗性機制中發揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】本文第1作者前期研究發現，來源于廣西的野生番茄材料F5高抗南方根結線蟲[16]，但目前對其抗病基因及抗性機制的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】檢測南方根結線蟲侵染和未侵染番茄抗性材料F5樣本的轉錄組，篩選番茄抗線蟲侵染相關基因，為其克隆及番茄抗病育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

番茄抗南方根結線蟲材料F5為第1作者在廣西柳州市郊區采集的野生番茄材料，經抗性鑒定屬于高抗材料[14]。供試南方根結線蟲采自廣西南寧市郊區蔬菜大棚，經單卵塊純化后接種于廣西農業科學院網室內番茄苗上繁殖備用。試驗時在解剖鏡下挑取南方根結線蟲卵囊，于25 ℃恒溫箱中孵化為二齡幼蟲。

1.2 線蟲接種與樣本采集

將番茄材料播種于育苗盆中，置于溫室內(平均氣溫25.63 ℃，平均相對濕度49.36 %，平均光照強度9930.00 lx)培養，待苗長至4片真葉時移栽于裝有無根結線蟲土壤的花盆(直徑20 cm，高12 cm)中，每盆種植3株，重復4次，共12株。移栽后10 d接種南方根結線蟲二齡幼蟲，每盆接種含有1500頭二齡幼蟲的線蟲液。對照接種等量清水。接種24 h后分別取番茄植株根尖組織3 cm約500 mg，液氮冷凍后，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3 RNA提取與檢測

對照組(LE-root)和試驗組(LE-rootm)番茄根尖組織總RNA由北京諾禾致源科技股份有限公司提取，以Nanodrop分光光度計檢測RNA純度，采用Agilent 2100核酸分析儀對提取的總RNA進行質量檢測。

1.4 文庫構建及測序

對檢測合格的總RNA用帶有Oligo(dT)的磁珠進行mRNA富集，然后加入Fragmentation Buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA Polymerase Ⅰ合成二鏈cDNA，隨后對雙鏈cDNA進行純化、末端修復、加尾并連接測序接頭，最后進行片段大小選擇和PCR富集獲取cDNA文庫。文庫檢測合格后進行Illumina HiSeqTM4000。

1.5 測序數據處理與分析

測序得到的原始圖像數據文件經CASAVA堿基識別(Base calling)分析轉化為原始測序序列(Original sequence)。對原始數據(Raw reads)進行過濾，去除帶接頭和N比率大于10 %及低質量的Reads，得到高質量序列(Clean reads)。將Clean reads與番茄參考基因組數據庫(https://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersi-coides/genome)進行比對后進行分類注釋和分布情況統計。

1.6 差異表達基因篩選

對測序得到的原始Reads進行評估，經TMM標準化處理后，獲得對照組(LE-root)和試驗組(LE-rootm)的基因表達量。根據模型進行假設檢測概率計算，最后進行多重假設檢驗校正得到PDR值，并以|log2(Fold change)|>1和q-value<0.005為標準對差異表基因進行篩選。

1.7 差異表達基因本位數據庫(GO)和Pathway顯著性富集(KEGG)分析

基于GO，分別從分子功能(Molecular function)、生物過程(Biological process)和細胞組成(Cellular component)3個部分對差異表達基因進行GO注釋；以KEGG數據庫中的Pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比在差異表達基因中顯著性富集的Pathway，采用Fisher進行精確檢驗，通過Bonferroni校正法進行校正，得到差異基因顯著富集的GO功能類和代謝通路，從中篩選顯著差異表達基因進行重點分析。

2 結果與分析

2.1 番茄根尖組織總RNA的檢測結果

經檢測，所提取對照組(LE-root)和試驗組(LE-rootm)番茄根尖組織樣本的總RNA濃度分別為896和1021 ng/μl，RNA質量完整性指標(RIN)分別為8.1和8.5，說明番茄根尖組織樣本的總RNA濃度及質量均滿足測序要求。

2.2 HiSeq測序數據分析結果

對照組(LE-root)和試驗組(LE-rootm)的原始數據統計結果(表1)顯示，Raw reads數分別為58 604 202和55 241 162條，經過濾得到Clean reads數分別為55 983 020和52 789 772條，分別占總Raw reads數的95.52 %和95.56 %，測序cDNA讀取量分別為8.40和7.92 G，滿足Q20分別為97.58 %和97.62 %，滿足Q30分別為93.84 %和93.94 %，GC含量分別為42.28 %和42.15 %。說明HiSeq測序質量較高，能滿足進行后續生物信息學分析要求。

表1 原始圖像數據的質控結果統計Table 1 Quality control of raw data

2.3 Reads與參考基因組的比對結果

Reads與參考基因組比對結果(表2)顯示，對照組(LE-root)和試驗組(LE-rootm)的Reads與參考基因組的比對效率分別為86.39 %和85.76 %，Multiple mapped reads分別為0.85 %和0.70 %，均小于1.00 %，表明測序質量及所選基因較好，可滿足后續分析需求。

表2 Reads與參考基因組比對結果統計Table 2 Comparison of Reads and reference genomes

2.4 差異表達基因篩選結果

將對照組(LE-root)與試驗組(LE-rootm)的測序數據進行比對分析，結果(圖1)顯示有1116個基因差異表達，其中731個基因上調表達，385個基因下調表達，上調表達基因數約為下調表達基因數的1.9倍，說明接種根結線蟲后番茄中有更多的基因通過上調表達響應根結線蟲侵染。

2.5 差異表達基因的GO功能注釋分析結果

對差異表達基因進行GO分析，其功能歸類于生物過程、細胞組分和分子功能三大類1830個條目。從圖2可看出，在分子功能中，差異表達基因富集在16個GO條目，較顯著的分子功能GO條目包括結合、轉錄因子激活、分子功能調控和酶活性催化等；生物過程富集在13個GO條目，較顯著的生物過程GO條目包括刺激反應、生物調節和代謝過程等；細胞組分中所有的差異表達基因均富集在胞外區條目。從圖3可看出，生物過程、分子功能和細胞組分分別富集在15、14和1個GO條目；在分子功能中，較顯著的GO條目包括轉運活性、過氧化物酶活性和抗氧化活性等；在生物過程中，較顯著的分子功能GO條目包括刺激應答、壓力應答和代謝應答等。

2.6 差異表達基因的KEGG分析結果

對差異表達基因進行KEGG分析發現，差異表達基因富集于94條KEGG代謝通路中，富集上調表達基因最多的為植物與病原互作通路，其次為類胡蘿卜素生物合成和維生素B6代謝通路，富集下調表達基因最多的為苯丙氨酸代謝通路，其次為類苯基丙烷生物合成和植物激素信號轉導通路。由表3可知，富集差異基因最多的是代謝途徑，共富集79個差異表達基因，其次為次生代謝物的生物合成和植物與病原互作途徑，分別富集45和18個差異表達基因。由表4可知，富集差異基因最多的是苯丙氨酸代謝和植物激素信號轉導途徑，均富集14個差異表達基因，其次為類苯基丙烷生物合成途徑，共富集11個差異表達基因。

表3 番茄根尖組織樣本間上調表達基因的KEGG分析結果Table 3 The KEGG annotations analysis of up-regulated genes in tomato root tip samples

表4 番茄根尖組織樣本間下調表達基因的KEGG分析結果Table 4 The KEGG annotations analysis of down-regulated genes in tomato root tip samples

2.7 差異表達的抗病相關基因

為研究番茄抗性材料對南方根結線蟲的抗性響應，對接種24 h后差異表達的基因進行分析，結果發現22個植物與病原物互作相關基因差異表達。其中，18個抗病相關基因上調表達，包括12個Ca+-CaM/CML信號相關基因(11個類鈣調蛋白CML、1個鈣調蛋白CaM)、3個WRKY轉錄因子、1個環核酸門控離子通道(CNGCS)蛋白、1個熱激蛋白和1個RBOH蛋白；差異表達最明顯的是Solyc11g071760.1、Solyc11g071750.1和Solyc02g09 4000.1 3個鈣調蛋白CML，差異倍數分別為4.73，3.50和3.34(表5)；3個WRKY轉錄因子分別為WRKY22、WRKY26和WRKY33A，分別上調表達2.61、2.32和1.90倍；1個環核酸門控離子通道(CNGCS)蛋白為CNGC15b-lik，上調表達294倍。說明Ca+-CaM/CML信號、WRKY轉錄因子和環核甘酸門控離子通道是番茄抗性材料F5對南方根結線蟲抗性反應的重要機制。

表5 上調表達的抗病相關基因Table 5 Up-regulation of disease-resistant genes

3 討 論

番茄抗根結線蟲基因的挖掘工作始于20世紀40年代，迄今已發現了10個抗性基因，其中Mi-1基因是目前唯一被應用的抗病基因，但Mi-1基因具有熱不穩定性，且自然界中存在部分或全部打破Mi-1基因抗性的線蟲群體。因此，從番茄材料中尋找新的抗病相關基因，將有利于加快抗病育種進程，促進抗病品種在生產上應用。本研究采用高通量測序技術對南方根結線蟲侵染和未侵染番茄抗性材料F5樣本的轉錄組進行檢測，鑒定并挖掘與線蟲響應相關的基因，共分離獲得1116個差異表達基因，其功能歸類于生物過程、細胞組分和分子功能三大類1830個條目，顯著富集于94條KEGG代謝通路；對差異表達基因進行GO和KEGG分析發現，植物與病原互作相關的22個基因差異表達，其中18個抗性相關基因上調表達，上調表達明顯的抗性基因包括11個類鈣調蛋白、1個鈣調蛋白、3個WRKY轉錄因子和1個環核甘酸門控離子通道蛋白。

Tuteja和Mahajan[17]、White和Broadley[18]研究認為，鈣調蛋白和類鈣調蛋白是Ca+-CaM/CML信號系統的重要組分，其與Ca2+結合后所形成的復合體能快速激活一系列蛋白，從而調控植物對不良環境和其他生物干擾的反應。CAMTA(CaM-binding Transcription activator)是CaM調控的轉錄激活因子家族之一，Rahman等[19]研究發現，CAMTA3參與調控油菜對菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)的免疫和抗性過程需要結合CaM。本研究中，接種南方根結線蟲后24 h，18個上調表達的抗病相關基因中有12個Ca+-CaM/CML信號通路相關基因，其中有1個鈣調蛋白和11個類鈣調蛋白，上調表達最高達4.73倍，表明番茄抗性材料F5在響應南方根結線蟲侵染過程中，Ca+-CaM/CML信號通路可能參與調控番茄對線蟲的抗性反應，與Rahman等[19]的研究結果一致，但這些CaM/CML在番茄響應線蟲侵染反應中的功能及調控網絡還需進一步探究。

WRKY轉錄因子在植物的抗病防衛反應中發揮重要調控作用，可通過與抗病相關蛋白基因啟動子區W-box相結合激活下游抗病基因表達，從而開啟植物的抗病防衛系統[20-21]。大量研究表明，WRKY轉錄因子在植物抗病調控中的作用大多依賴于茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)[20-22]。Bhattarai等[23]利用基因芯片分析發現，在Mi基因介導的番茄抗根結線蟲反應中WRKY轉錄因子SlWRKY72a/SlWRKY72b上調表達，沉默SlWRKY72a/SlWRKY72b可降低番茄對根結線蟲的抗性。Chinnapandi等[24-25]研究發現，SlWRKY45可能通過激活依賴于SA的信號傳導路徑調控抗線蟲反應，SlWRKY3通過激活脂質和激素介導的防御信號通路，對爪哇根結線蟲(M.javanica)起正向調控作用。本研究結果與上述研究結果相似，接種南方根結線蟲后24 h，有3個WRKY轉錄因子(WRKY22、WRKY26和WRKY33A)上調表達，上調倍數分別為2.61、2.32和1.90倍，說明這3個WRKY轉錄因子在番茄抗性材料F5響應南方根結線蟲侵染過程中發揮了一定作用，但其抗線蟲調控機制有待進一步探究。

植物的環核甘酸門控離子通道能直接被激活，也可以通過與環核甘酸(cAPM/cGMP)可逆性結合被激活，參與調控植物細胞的離子運轉、病原體防御應答和生長發育等[26-27]。Balague等[28]研究顯示，擬南芥AtCNGC4可通過參與病程相關蛋白(PR)基因的組成表達，增強對強毒性病原體的廣譜抗性。本研究發現，接種南方根結線蟲后24 h，1個環核甘酸門控離子通道蛋白基因上調表達，上調表達倍數為2.94倍，說明該基因可能參與調控番茄抗性材料F5對南方根結線蟲的防御應答，但其是否與AtCNGC4一樣可通過與其他抗性相關基因間組成調控網絡增強F5對線蟲的抗性還需進一步探討。

4 結 論

Ca+-CaM/CML信號、WRKY轉錄因子、環核甘酸門控離子通道是番茄抗性材料F5對南方根結線蟲抗性反應的重要機制，可作為深入探索根結線蟲與番茄互作及挖掘番茄關鍵抗性相關基因的參考依據。