酉州烏羊皮膚組織ASIP基因的RACE克隆及分析

付 琳，孫曉燕，任航行，李 杰，蔣 婧，王高富*

(1.重慶市畜牧科學院,重慶 榮昌 402460；2重慶市山羊工程技術研究中心,重慶 榮昌 402460)

【研究意義】膚色是一些哺乳動物(或品種)區分的標志之一[1]，可能與生產性能有直接的關系[2]，因此膚色在分子水平上成了動物的一個重要的育種性狀，然而色素的表型具有高度多態性及不易于統計區分性，給其調控毛色的分子機制研究帶來了困難[3]。【前人研究進展】ASIP(Agouti signaling protein，ASIP) 基因在哺乳動物的色素由真黑色素向棕黑色素轉變過程中起著重要的作用，是研究動物群體或個體毛發、膚色表型差異的主要候選基因之一[4]，其突變對多種哺乳動物(小鼠、人、馬、豬、牛、狗、貓、兔、兔、綿羊、山羊)毛色表型變化具有重要的影響[5-14]。ASIP基因包含多個等位基因位點，使動物皮膚與毛色呈現出廣泛的表型。研究表明，ASIPmRNA在人、豬、綿羊、山羊、牛等哺乳動物的多個組織里廣泛表達，推測在人和家畜中具有復雜且多樣性的功能[15]，除了影響哺乳動物毛發與皮膚的色素沉積性狀，ASIP基因同時可能也參與脂肪能量代謝、癌癥等活動[16-17]。同時，對毛色與疾病的相關性研究，也可為診斷和治療相關色素類疾病提供有益參考。在多種哺乳中已經獲得了全部或者部分ASIP基因序列，山羊ASIP基因已定位于13q22[18]。【本研究切入點】對ASIP基因調控機制充分探索可為哺乳動物品種資源的保存與利用提供有益參考[19]。酉州烏羊是我國珍貴的地方特色遺傳資源，是一種全身具烏皮表型的哺乳動物，不但具有良好的食、藥兼用性[20]，也有望作為研究皮膚黑色素沉積的良好素材，發揮更多的作用。本研究采用RACE技術擴增酉州烏羊ASIP基因mRNA，通過預測分析其編碼蛋白的理化性質和結構特點，初步揭示酉州烏羊ASIP基因的序列結構特征。【擬解決的關鍵問題】為ASIP基因影響酉州烏羊皮膚色素沉積的分子機制研究提供理論基礎，也為后續深入開展ASIP基因對皮膚色素沉積與機體脂肪、能量代謝之間的互作機制探索提供理論參考。同時還對酉州烏羊肉質性狀分子標記的開發具有潛在的應用價值，從而加快這一特色品種的選育進程，最終提高社會、生態與經濟效益。

1 材料與方法

1.1 酉州烏羊ASIP基因RACE克隆

1.1.1 樣品采集、RNA提取、純化及反轉錄 在重慶市酉陽縣酉州烏羊資源保護場采集9只酉州烏羊的皮膚組織，迅速裝入做好標記的采樣管中，立即投于液氮中帶回實驗室置于-80 ℃冰箱保存樣品。按TaKaRaRNAiso Plus試劑盒說明提取總RNA，NANODROP 2000超微量分光光度計測定其濃度和純度測定后，取3 μl待檢測的RNA與l μl的上樣緩沖液混勻，經1.0 %瓊脂糖凝膠160 V，150 mA電泳12 min，在凝膠成像系統下觀察檢測結果，并進行拍照保存，將28S和18S條帶的亮度和寬度比例均為 2∶1 的 RNA按SMARTer RACE 5′3′cDNA Amplification Kit說明書反轉錄，反轉錄產物保存于-20 ℃備用。

1.1.2 RACE引物設計 以山羊ASIP基因的mRNA序列(登錄號NW_005100804)為模板，SMARTer RACE 5′3′ cDNA Synthesis Kit中10×Universal Primer A Mix (UPM)和Nested Universal Primer Short為上游引物(表1)，設計5′ RACE下游引物與3′ RACE 上游引物作為試驗的引物(表1)。

表1 5′和3′ RACE引物Table 1 Primers for 5′ and 3′ RACE

1.1.3 RACE反應條件和克隆測序 按照SMARTer RACE 5′3′cDNA Amplification Kit說明書進行Outer RCR 和 Inner PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，高亮的條帶進行切膠回收。將Inner PCR產物通過TA克隆鏈接到pMD19-T載體上，過夜培養，挑取白色且形狀圓潤的單菌落至含有Amp+的LB液體培養基中，37 ℃搖床振蕩過夜培養，菌液PCR鑒定重組子，陽性克隆送往上海生工生物技術公司測序。

1.2 蛋白質序列的生物信息學分析

以NCBI數據庫中已發表的山羊序列為基礎，使用DNAStar軟件包對酉州烏羊ASIP基因序列進行編輯；使用Editseq軟件查找開放閱讀框，確定其CDS的范圍；采用NCBI在線同源搜索工具BLAST，確定所獲序列是否為目的基因序列；利用Mega 6.0進行多序列比對并構建進化樹，分析酉州烏羊與其他物種ASIP的進化關系。酉州烏羊ASIP蛋白的理化性質的分析采用ExPASy在線工具(http://web.expasy.org/protparam/)，信號肽預測采用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，保守結構域分析采用NCBI在線工具CD-Search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。二級結構用在線軟件SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa)預測。三級結構利用在線同源建模SWISS-MODEL(http://www.expasy.org/swissmod/SWISSMODEL.html)進行預測。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取結果

按照RNAisoPlusRNA試劑的說明提取酉州烏羊皮膚組織樣品總RNA，并用2 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。圖1中3條清晰的條帶從上到下依次為28S、18S和5S，且2S條帶亮度是18S的2倍。經核酸蛋白測定儀檢測其純度和濃度后，總RNA的A260/A280的范圍均在1.8～2.1，符合實驗質量要求。

2.2 山羊ASIP mRNA序列克隆結果

OuterPCR的擴增產物均無特異帶，整個電泳條帶呈現彌散狀，故將outerPCR產物稀釋后進行InnerPCR。InnerPCR擴增產物中出現的條帶分別切膠回收后連接至載體。經電泳檢測，2個酉州烏羊樣品5′RACE結果顯示2種帶型，其余樣品為1種帶型，所有3′RACE結果顯示只有1種帶型(圖2)。

2.3 目的基因的鑒定

將測序結果使用BioEdit7.0軟件比對拼接后，得到一段787 bp的序列，標為P1，包括209 bp的5′UTR區，402 bp的CDS區以及176 bp的3′UTR區，預測編碼133個氨基酸(圖3)，在編碼區存在異義替換c.496G>T，其編碼的氨基酸在第96位由谷氨酸轉變為纈氨酸(p.Ala96Val)。在NCBI數據庫中進行BLAST搜索比對，其與牛科物種ASIPmRNA序列相似度達96 %以上，與山羊的相似度高達99 %以上，證明該序列確為酉州烏羊的ASIPmRNA序列。與NCBI中山羊ASIPmRNA(NW_005100804)比對顯示，P1無法與Exon1、Exon2匹配，在Exon3最末處缺失一個堿基G，與Exon4相似度為100 %，Exon5末端缺失5個堿基GAAAA。

5′RACE測序結果出現2條不同的序列，分別標為P2(341 bp)和P3(497 bp)。P2片段為所有酉州烏羊共有的轉錄本，P3片段只出現在1個酉州烏羊樣品中。經BLAST比對，P2片段與牛科物種IIIA3基因相似度達94 %，P3片段與牛科物種TNNI2基因相似度達96 %(圖4～5)。

2.4 物種間氨基酸序列相似性

采用在線工具Blastx對P1片段翻譯得出其編碼133個氨基酸，與NCBI中山羊ASIP(XP_017913224.1)氨基酸的相似性為99 %。采用基于遺傳距離的鄰近法對10個物種(酉州烏羊、山羊、綿羊、普通牛、水牛、駱駝、鹿、野豬、馬、人類)的ASIP氨基酸序列進行聚類分析(圖6)。山羊最先與分類學上同屬羊亞科的綿羊聚為一類，接著與牛科動物聚為一類，然后與同是反芻動物的鹿聚成一類，再依次是駱駝、豬、馬和人類，這一結果與動物進化規律較為一致。在第96位處氨基酸，其他物種為丙氨酸A，酉州烏羊表現為纈氨酸V(p.Ala96Val)，如紅色方框位置所示(圖7)。

2.5 酉州烏羊ASIP蛋白分析

2.5.1 酉州烏羊ASIP蛋白質理化性質預測 從表2可知，該蛋白質的分子式為 C635H1055N193O182S15，原子總數為2080，蛋白分子質量為14 786.45 Da，理論等電點為9.63，其氨基酸組成中，脯氨酸數量(Pro，P)最多，總數為14個，占10.5 %；亮氨酸(Leu，L)與賴氨酸(Lys，K)其次，總數均為13個，占9.8 %；谷氨酰胺(Gln，Q)、甘氨酸(Gly，G)、組氨酸(His，H)、酪氨酸(Tyr，Y)數量最少，為1個，占0.8 %。總的帶負電殘基(Asp + Glu)為10，總的帶正電殘基(Arg+Lys)為25。在第10、11位氨基酸處具有疏水最大值2.978，在第31位氨基酸處最具有疏水小值-3.556，總平均親水性為-0.401，不穩定系數為54.02，預測該蛋白為親水性不穩定蛋白(圖8)。SignalP 5.0預測其有一個22長度的信號肽，剪切部位在22～23氨基酸處。與山羊ASIP(XP_017913224.1 )相比，蛋白分子式、原子總數、蛋白分子量、平均親水性、不穩定系數有一定差異。

表2 酉州烏羊ASIP理化性質預測Table 2 The prediction of YZD ASIP physical and chemical properties

2.5.2 酉州烏羊ASIP蛋白功能結構域預測 蛋白功能結構域預測結果顯示，酉州烏羊ASIP蛋白在16～129位為Agouti信號蛋白家族保守結構域。Agouti結構域是富含半胱氨酸的C末端模塊，其負責體外黑皮質素受體的結合活性(圖8)。

2.5.3 酉州烏羊ASIP蛋白二級結構預測 從圖9可知，其中構建α螺旋的氨基酸為42AA(31.58 %)，構建延伸鏈的氨基酸為15AA(11.28 %)，構建β轉角的氨基酸為7AA(5.26 %)，無規則卷曲為69AA(51.88 %)。NCBI山羊ASIP(XP_017913224.1)的二級結構預測的相對應數據分別為α螺旋42AA(31.58 %)，延伸鏈7AA(5.26 %)，β轉角3AA(2.26 %)，無規則卷曲81AA(60.90 %)，與之相比，酉州烏羊ASIP二級結構發生了改變。

2.5.4 酉州烏羊ASIP蛋白三級結構預測 使用在線工具SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預測三級結構，如圖10所示，酉州烏羊ASIP第96為纈氨酸(V)，而山羊ASIP第96位為丙氨酸(A)，三級結構預測顯示在其96位氨基酸的氫鍵構成有差異，空間結構發生變化。

3 討 論

3.1 ASIP基因的結構與功能

本試驗采用5′與3′RACE較完整地擴增出了酉州烏羊ASIP基因(787 bp)序列，包括209 bp的5′ UTR區，402 bp的CDS區，以及176 bp的3′ UTR區。研究表明動物皮膚組織中ASIP基因非編碼區的變異可能影響毛色的變化[21]，5′ UTR區序列的獲得為以后深入研究山羊ASIP非翻譯區的功能提供了基礎。生物信息學預測酉州烏羊ASIP蛋白有一個長度為22個氨基酸的信號肽，切割位點位于22～23氨基酸處，在16～129位為Agouti信號蛋白家族保守結構域，與景炅婕等[22]對太行山羊的研究報道一致。ASIP蛋白可與α-MSH競爭性結合MC1R，調節真黑色素和褐黑色素生成的數量與比例，從而使動物表現出不同的毛色或膚色。該研究中發現的酉州烏羊ASIP基因編碼區異義替換c.496 G>T，預測其導致編碼的氨基酸由丙氨酸替換為纈氨酸(p.Ala96Val)，正位于Agouti信號蛋白家族保守結構域上，而該結構域是富含半胱氨酸的C末端模塊，負責MC1R的結合活性，這一異義替換還造成了酉州烏羊ASIP二級結構域和空間構象的差異，結合蛋白質理化性質比較分析，推測其可能對ASIP蛋白的功能產生影響。

此外，5′ RACE結果中所有酉州烏羊個體中都出現了1條共有序列P2，其中1只出現了特有的序列P3，但無法與山羊ASIPmRNA序列匹配，P2與牛科物種IIIA3基因相似度達94 %，P3與牛科物種TNNI2基因相似度達96 %以上，這2個序列可能以融合基因的形式發揮作用，這一現象與酉州烏羊這一特色品種的基因組異常復雜有關，因此有待于獲取酉州烏羊全基因組序列并進一步分析，從而進一步探索ASIP基因在山羊體內的調控途徑。

3.2 ASIP基因的變異與山羊毛發、皮膚顏色的關系

國內外已有報道表明ASIP是影響綿羊與山羊毛色的一個重要候選基因。綿羊ASIP基因突變對各類毛色模式的分布有重要影響[23-24]。大量山羊ASIP位點的等位基因被報道，但ASIP等位基因與毛色、膚色相關研究所得結果與綿羊有差異[25-26]。Tang等[27]發現山羊ASIP基因外顯子4的一個片段中的423G>T的顛轉替換可能是與山羊黑色皮毛表型有關，并且ASIP基因第1內含子的T128缺失可能也在山羊毛色形成過程中發揮一定作用[21]。Henkel等[28]揭示了幾種瑞士山羊品種ASIP等位基因不同的CNV，其導致了ASIP在山羊皮膚上黑色素區域和棕黑色素區域之間的不同表達。Fontanesi等[25]在6個山羊品種的ASIP基因的編碼區鑒定出5個單核苷酸多態性(SNPs)，與山羊的毛色沒有聯系或沒有完全聯系。Badaoui等[29]在12個西班牙和意大利山羊品種中鑒定了兩個錯義突變和兩個內含子SNPs，其中一個錯義突變(Cys126Gly)可能通過破壞高度保守的二硫鍵引起結構變化，然而未觀察到其與毛色有明顯聯系。Adefenwa等[30]在不同地區的6個山羊品種ASIP基因的包括部分外顯子2和部分內含子2區域發現兩個突變位點，均與山羊被毛顏色無明顯的聯系。張天等[31]研究發現ASIP基因表達量與山羊毛色無相關性，提示其在不同毛色山羊皮膚組織中可能存在不同調控機制。綜上所述，不同山羊品種中ASIP基因對毛色影響的作用并不一致，ASIP基因編碼區的變異不能完全解釋山羊不同毛色的表型，關于ASIP對山羊毛色及膚色的影響機制仍未解析。上述研究同樣顯示了山羊皮毛顏色的遺傳復雜性，除了受遺傳因素的影響，還受環境因素的修飾。因此，需要對山羊ASIP基因啟動子序列、整個編碼區及非編碼區進行全面的分析，并與其他調控毛色、膚色的候選基因進行關聯分析，以確認表型的因果，及與其他基因的潛在的上位關系[32]，明確其對毛色的調控作用機制。關于本研究中酉州烏羊ASIP基因編碼區的異義替換是否影響酉州烏羊的烏色皮膚表型，還有待于擴大種群數量、增加比較的品種種類，進一步試驗驗證。

4 結 論

獲得酉州烏羊皮膚組織ASIP基因mRNA全序列(787 bp)，包括209 bp的5′ UTR區，402 bp的CDS區，以及176 bp的5′ UTR區，其編碼133個氨基酸。酉州烏羊ASIP基因編碼區發生異義替換c.496G>T，其編碼的氨基酸由丙氨酸轉變為纈氨酸(p.Ala96Val)，可能對酉州烏羊皮膚色素沉積性狀產生影響。本研究為ASIP基因影響酉州烏羊皮膚色素沉積的分子機制研究提供了理論數據。