復方中草藥對兔乳房炎的預防作用及其機制探討

韓 昱，張 寧，胡曉悅，肖文同，張立永，張富梅*

(1.河北北方學院實驗動物中心，河北 張家口 075000；2.河北省畜牧獸醫研究所，河北 保定 071000；3.唐山市動物衛生監督所，河北 唐山 063000；4.河北北方學院動物科技學院，河北 張家口 075000)

【研究意義】兔產業是畜牧業的重要組成部分，但在養殖過程中，母兔泌乳能力差嚴重制約了養兔業的發展，而乳房炎是導致母兔泌乳能力下降的主要疾病。隨著無抗養殖的實施和人民生活水平的不斷提升，養兔業面臨綠色、健康等新的挑戰。因此，探討中草藥防治乳房炎是促進兔業生態健康發展的重要措施?！厩叭搜芯窟M展】母兔乳房炎是母兔泌乳期最主要的疾病。肖文淵等[1]調查統計了西昌市的大量繁殖母兔，發現母兔淘汰率較高，有12.29 %的母兔患有乳房炎，仔兔斷奶后成活率較低。在防治乳房炎的用藥上，傳統方法是使用抗生素。而濫用抗生素會致使細菌耐藥性及藥物殘留的產生，耐藥菌株和殘留的抗生素通過食物鏈轉移給人類，對人類的健康造成危害。中草藥具有無抗藥性、無殘留、加工簡便，成本低廉等特點，而且在抗炎，增強機體免疫力等方面具有重要作用[2-3]。到目前為止，關于中草藥防治兔乳房炎及其機制的研究鮮見報道，尚未引起業界足夠重視?！颈狙芯壳腥朦c】本研究利用前期篩選確定的具有疏肝解郁、疏經通絡、活血下乳、清熱解毒、活血散瘀的復方中草藥[4]，進一步研究其在預防母兔乳房炎中的作用，并對其作用機制進行探討?！緮M解決的關鍵問題】本研究結果以期為廣泛推廣應用提供理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗用塞北兔由張家口某養殖場提供。母兔40只，年齡相同(12月齡左右)，胎次(2～3胎)、產奶量接近，窩產活仔數5～9只；健康公兔6只。中草藥購自河北北方學院校醫院。復方中草藥主要成分為黨參、炒白術、柴胡、金銀花、王不留行、通草、蒲公英等。將中草藥按照組方用超微粉碎機粉碎，均勻混合于飼糧中。

1.2 試驗設計

將選擇的試驗母兔40只隨機分為2組，即對照組和試驗組，每組20只。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組于產前15 d至產后15 d飼喂添加1.5 %復方中草藥的飼糧，其它時間飼喂基礎飼糧。試驗期從產前15 d至仔兔30 d斷奶，共45 d。在試驗期間，不改變兔原來的基礎飼糧配方、飼喂量、飼喂次數及時間，飼養環境及管理方法也不作改善和調整。按常規管理方法做好驅蟲、免疫、消毒工作。

1.3 檢測指標

1.3.1 母兔乳房炎發病率統計 連續統計對照組和試驗組中每只母兔各4窩次母兔乳房炎的發病數及淘汰母兔數，計算乳房炎發病率和母兔淘汰率。

1.3.2 母兔血液免疫指標的測定 于母兔產后4、10、20 d，分別從對照組和試驗組隨機選取10只母兔，采集血液，每次采血固定在上午8：00-10：00進行。每只兔無菌耳靜脈采血2份，1份不用抗凝劑(2 mL)，制備血清，分裝于1.5 mL離心管中，-80 ℃保存，用于血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、白細胞介素-2(IL-2)和白細胞介素-6(IL-6)含量的測定；另外1份用肝素鈉作為抗凝劑(2 mL)，用于分離淋巴細胞，測定T淋巴細胞百分率。①母兔血清中IgG、IgM、IL-2和IL-6含量的測定。血清樣品送河北博海生物工程開發有限公司，IgG、IgM、IL-2和IL-6含量均采用生物素雙抗體夾心ELISA方法進行測定。②T淋巴細胞百分率的測定。應用α-醋酸萘酯酶法(ANAE法)測定母兔血液中T淋巴細胞數，計算T淋巴細胞百分率。

1.3.3 母兔初乳IgG含量測定 從對照組和試驗組分別隨機選擇10只母兔，于分娩后24～48 h采集初乳，分置于1.5 mL離心管中，-80 ℃保存。樣品送北京華英生物技術研究所，測定初乳中IgG含量(比色法)。

1.3.4 仔兔血清IgG及血清蛋白含量的測定 分別于產后5～6 d隨機從每組選擇10只母兔，在每只母兔所產仔兔中選擇接近平均體重的仔兔，無菌采集仔兔血液，制備血清，分裝于1.5 mL離心管中，-80 ℃保存。樣品送北京華英生物技術研究所，采用比色法測定血清IgG以及總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)含量，并計算血清球蛋白(GLB)含量。

GLB含量=TP含量-ALB含量

1.4 數據的統計

分析采用 SPSS19.0 軟件對試驗數據進行單因素方差分析，結果以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 復方中草藥對母兔乳房炎發病率的影響

由表1顯示，在繁殖窩次相同的條件下，對照組乳房炎發病率為12.5 %，母兔淘汰率為15 %。飼喂復方中草藥后，試驗組發病率降低到3.75 %，較對照組降低了8.75 %，母兔淘汰率降低到5 %，降低了10 %。說明本試驗所用復方中草藥可以明顯降低母兔乳房炎發病率，減少淘汰率。

表1 乳房炎發病率和母兔淘汰率統計Table 1 Statistics on incidence of mastitis and elimination rate of female rabbits

2.2 復方中草藥對母兔血液免疫指標的影響

2.2.1 復方中草藥對母兔血清中IgG、IgM及細胞因子IL-2和IL-6含量的影響 由表2表明，與對照組相比，分娩后4d試驗組血清中IgG、IL-2及IL-6含量均有一定的增加，但差異不顯著(P>0.05)，IgM含量顯著提高(P<0.05)；分娩后10 d試驗組血清中IgG含量顯著升高(P<0.05)，IgM、IL-2及IL-6含量極顯著增加(P<0.01)；分娩后20 d試驗組血清中IgG、IgM含量顯著升高(P<0.05)，IL-2含量極顯著增加(P<0.01)，IL-6含量有升高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。由此提示，所用復方中草藥能夠有效提高母兔血清中的免疫指標水平，對母兔的免疫機能具有顯著的增強作用。

表2 母兔血清中IgG、IgM、IL-2和IL-6含量測定Table 2 Results of determination of IgG,IgM,IL-2 and IL-6 in the serum of female rabbits

2.2.2 復方中草藥對母兔血液T淋巴細胞百分率的影響 由表3顯示，與對照組相比，分娩后4 和10 d，試驗組血液中T淋巴細胞百分率均呈現顯著增加(P<0.05)，分娩后20 d T淋巴細胞百分率具有升高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。該項結果表明，復方中草藥能夠有效提升母兔的細胞免疫水平，進而也可促進機體免疫性能的提高。

表3 母兔血液T淋巴細胞百分率測定Table 3 Results of determination of blood T lymphocyte percentage in female rabbits

2.3 復方中草藥對母兔初乳IgG含量的影響

由表4顯示，試驗組母兔初乳中IgG含量較對照組顯著提高，提高了6.45個百分點(P<0.05)。由此可見，飼糧中添加復方中草藥可以顯著提高母兔初乳中IgG含量，從而對增強初生仔兔的被動免疫發揮了重要作用。

表4 母兔初乳IgG含量測定結果Table 4 Result of determination of IgG content in female colostrum

2.4 復方中草藥對初生仔兔血清IgG及血清蛋白含量的影響

由表5顯示，試驗組初生仔兔血清中IgG水平明顯升高，較對照組差異顯著(P<0.05)；TP、GLB含量顯著增加(P<0.05)，ALB含量也有所提高，但差異不顯著(P>0.05)。結果表明，分娩前后母兔飼糧中添加復方中草藥可以有效提高初生仔兔免疫水平，有助于促進其健康生長。

表5 仔兔血清IgG及血清蛋白含量的測定Table 5 Determination of serum IgG and serum protein in young rabbits

3 討 論

3.1 復方中草藥對母兔乳房炎的預防作用

傳統方法中，防治兔乳房炎普遍采用抗生素[5-6]。

成栓之[7]研究發現，復方環丙沙星等能夠有效治療母兔乳房炎。但另有研究發現，在預防兔乳房炎上，磺胺嘧啶西藥配方效果不佳，可能菌株對該藥品產生耐藥性所致[1]?？股貫E用導致的藥物殘留和病原菌耐藥性增強等問題亟待解決。因此，在生態健康養殖大環境下，應用中草藥防治兔乳房炎是發展趨勢。

目前，關于中草藥對動物乳房炎的影響研究，主要集中在牛乳房炎的防治上，并取得了較好成效。沃野千里等[8]研究發現，應用黃芪多糖替代抗生素來預防和控制奶牛乳房炎有較好的前景；凌丁等[9]對奶牛飼喂黃芪、黨參等中草藥添加劑，發現能夠防治奶牛隱性乳房炎，可有效降低隱性乳房炎的發病率，提高產奶量；另外，有學者在植物提取物對奶牛乳房炎的作用及其機制方面進行了綜述，認為其能夠作為部分抗生素的替代物，成為奶牛乳房炎的新型防治手段[10-11]。有關中草藥預防母兔乳房炎，我國學者也進行了初步探索，但缺乏系統深入的研究。肖文淵等[1]利用蒲公英復方進行齊卡白兔母兔乳房炎預防試驗，結果發現其能夠有效預防乳房炎，發病率由12.82 %降為5.13 %，母兔淘汰率由15.38 %降為7.69 %。本試驗在分娩前后母兔的飼糧中添加復方中草藥，結果發現，母兔乳房炎發病率降低為3.75 %，較對照組降低了8.75個百分點，母兔淘汰率試驗組僅為5 %，而對照組達到15 %。由此可見所用復方中草藥對預防母兔乳房炎具有明顯作用，這與上述肖文淵以及中草藥預防牛乳房炎的研究結論一致。同時，課題組前期試驗發現，該復方中草藥可以顯著提高母兔泌乳力，改善乳成分，提高斷奶仔兔成活率且促進仔兔生長[4]，本試驗為上述結論提供了進一步的佐證。

3.2 復方中草藥預防母兔乳房炎作用機制探討

關于中草藥預防乳房炎的作用機制，國內學者開展了一些研究，主要集中在如何提高機體免疫性能方面[2-3]。反應機體免疫性能的指標除了參與非特異性免疫的吞噬細胞外，主要還有免疫球蛋白以及一些細胞因子等。免疫球蛋白Ig在機體內發揮著特異性免疫作用，其中IgG可以調理、凝聚和沉淀抗原，發揮抗菌、抗病毒、抗毒素等免疫學活性，因而在機體免疫保護中發揮關鍵作用；IgM在機體對感染的免疫應答過程中較先發揮作用，具有較強的殺菌、溶菌、促吞噬、中和毒素和抗病毒等免疫活性[12]；T淋巴細胞作為重要的免疫細胞，若出現免疫缺陷或低活性，機體免疫功能會降低[13]；IL-2和IL-6均是細胞因子。IL-2具有廣泛的生物學活性，最顯著的作用是影響T淋巴細胞的生長，并可促進活化B細胞增殖，使抗體分泌增多，故為調控免疫應答的重要因子，IL-6能夠刺激參與免疫反應的細胞增生、分化，并提高其功能[14-15]。

目前，關于中草藥防治兔乳房炎的作用機制，尚缺乏深入的探究，限制了中草藥防治兔乳房炎的推廣應用。本試驗在這方面開展了研究。選用的復方中草藥主要由蒲公英、金銀花、黨參、柴胡、王不留行、通草等組成。蒲公英和金銀花具有清熱解毒、活血散瘀、消除炎癥的作用。易瓊等[16]研究發現，治療奶牛隱性乳房炎的復方中草藥(蒲公英、金銀花、連翹等)提取液可使小鼠的脾臟指數、胸腺指數以及外周血中性粒細胞吞噬金黃色葡萄球菌、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數較對照組顯著提高；周秀萍等[17]發現，服用金銀花后能顯著提高大鼠巨噬細胞吞噬率及吞噬指數，使機體的淋巴細胞轉化率增加，同時強化Th1細胞分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ，提示金銀花對機體的免疫功能具有提升作用；黨參具有補中益氣、生津之功效，柴胡具有疏肝解郁、理氣瀉火的作用。近年來許多醫學研究人員發現運用柴胡皂苷能夠在體液以及細胞免疫反應中發揮巨噬細胞以及淋巴細胞功能的調整，并且可以借助激活機體巨噬細胞的方式來活躍其體內的免疫淋巴細胞功能，從而取得反應時免疫激活的效果[18]。通草、王不留行主要具有活血通絡、消腫下乳的作用。有學者報道王不留行具有活血通經、消腫、催乳等功效，從而減少乳房炎的發生，提高奶牛泌乳機能、產奶量和乳品質[19]。本試驗在母兔分娩前后15 d日糧中添加了復方中草藥，測定了分娩后母兔4、10、20 d血液中相關免疫指標，結果發現，所用復方中草藥可以明顯提高分娩后母兔血清中IgG、IgM以及細胞因子IL-2、IL-6的含量，使母兔血液中T淋巴細胞百分率增加，即可增強和調節母兔的免疫機能，表現出與上述文獻報道相一致的結論。所選用復方中草藥整體具有疏肝解郁、疏經通絡、活血下乳、清熱解毒、活血散瘀的功效，可以提高母兔的免疫力和抗病能力，從而降低了乳房炎發生率和淘汰率，這充分顯示出所用復方中草藥能有效預防母兔乳房炎的重要機制之一就是增強機體抵抗力。

眾所周知，初乳對于初生動物獲得被動免疫非常重要。由于許多母畜的抗體不能通過胎盤傳遞給胎兒，所以在胎兒階段以及剛出生的幼畜血液中，一般都不含兔疫球蛋白或其含量很低，因此幼畜易感染多種病原微生物。幼畜得不到足夠的母源抗體往往是造成其患病或死亡的重要原因。IgG作為初乳中主要的免疫球蛋白，具有溶解有害菌、活化補體等作用，能夠對胎兒傳導免疫力，從而提升其抗感染能力[14]。有研究發現，對出生12 h內犢牛飼喂初乳，其結腸中與粘膜和消化道相關的總細菌的豐度更高，病原性大腸桿菌和大腸桿菌-志賀氏菌屬減少[20]；另有報道稱，母源抗體水平是被動免疫和防止犢牛腹瀉的重要因素，通過初乳被動獲得的抗體能夠使犢牛免受腹瀉的侵害[21]。本試驗結果顯示，分娩前后母兔飼糧中添加復方中草藥可以明顯提高初乳中IgG含量，而且測定產后5～6 d仔兔血清中IgG及總蛋白和球蛋白含量顯示，均較對照組顯著提高。這說明仔兔通過初乳抗病能力得到相應提高，這也是前期試驗中所用復方中草藥提高斷奶仔兔成活率，進而促進仔兔健康生長的又一個重要原因[4]。

4 結 論

分娩前后母兔飼糧中添加適量復方中草藥，可以有效降低乳房炎發病率和母兔淘汰率，其作用機制是應用復方中草藥能顯著提高分娩后母兔免疫球蛋白IgG、IgM和細胞因子IL-2、IL-6的水平，以及T淋巴細胞百分率，進而增強了母兔免疫能力，提高抗病能力；母兔飼糧中添加復方中草藥，可以顯著提高初乳中IgG含量，使仔兔免疫力和抗病力增強，有利于促進仔兔健康生長。本研究為促進所選復方中草藥的廣泛推廣應用提供了充分的理論依據，為促進養兔業生態健康發展探索出有效路徑。