鳶尾屬植物花器官總RNA不同提取方法的比較分析

羅夢瑤，王有國*，馬璐琳

(1. 云南農業大學園林園藝學院, 云南 昆明 650201; 2.云南省農業科學院花卉研究所/ 云南省花卉育種重點實驗室/ 國家觀賞園藝工程技術研究中心, 云南 昆明 650205)

【研究意義】鳶尾屬(IrisL.)植物花姿奇特，花色豐富艷麗，栽培歷史久遠，為世界著名觀賞植物[1-2]。全世界鳶尾屬植物約有 300 余種, 生長氣候以北溫帶為主，分布區域集中在亞洲、歐洲及北美洲。中國是鳶尾屬植物的分布中心之一，已知的鳶尾屬植物有64個種，13個變種，1個亞種和6個變型，主要分布于西南、西北和東北[3]。鳶尾(I.tectorumMaxim.)和西南鳶尾(I.bulleyanaDykes)都為鳶尾屬多年生草本植物，云南是鳶尾和西南鳶尾的主要分布地區之一。鳶尾在中國分布范圍相對較廣，主產地為四川、重慶、貴州、云南和廣西等地。鳶尾花冠大，花色藍紫色，花期較長，在生態園林上有著廣泛的應用前景，此外，其根莖“川射干”常用來藥用[2, 4]；西南鳶尾主要分布于中國西藏、四川、云南等地在海拔2300 ～ 3500 m的灌木林緣及水邊濕地上，花色藍色至藍紫色，外花被具藍紫色的斑點及條紋[5]。西南鳶尾花形美觀，具有很高的觀賞價值。可成片種植于園林綠地中，也可以與其它植物搭配，豐富群落層次，增強景觀效果。【前人研究進展】目前關于鳶尾屬植物的研究主要集中在系統分類、栽培應用、種子萌發、化學成分鑒定及細胞學研究等領域[4, 6-10]，而關于鳶尾屬植物分子生物學方面的研究較少，僅見少量鳶尾屬植物遺傳多樣性分子標記[11-12]，以及鳶尾花色合成等相關基因的篩選克隆[13-16]等方面的研究。【本研究切入點】純度好、濃度高的植物總RNA是進行植物目標基因克隆、表達及調控等研究工作的前提和基礎[17]。不同的植物因其組織成分、內含化學物質等的不同，適用的RNA提取方法也有很大的差別[18]，植物的花器官組織常因含有較多的多糖、酚類、色素等物質，而影響花朵總RNA的提取質量和得率[19-20]。多糖類物質與RNA很難分離[21]，酚類物質容易被氧化后同RNA結合[22]，傳統的使用三氯甲烷的抽提方式很難除去色素[23]，且植物材料的保鮮程度也會影響RNA的提取。另外，RNA結構十分不穩定，容易降解。因此，成功提取出品質優良的RNA至關重要。【擬解決的關鍵問題】 采用Trizol 法、EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法和TransZol Plant試劑盒法3種方法提取鳶尾植物花朵RNA，并對RNA的質量、產量以及試劑費用等進行對比分析，以期找出提取新鮮及冷凍的鳶尾植物花器官組織總RNA的最適方法，為后續鳶尾屬植物分子研究工作奠定一定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

冷凍的西南鳶尾花蕾組織于2018年6月29日采自云南省迪慶州香格里拉縣城郊外，于液氮中處理后-80 ℃冰箱保存。新鮮的鳶尾花蕾于2019年3月6日采自云南省農業科學院綠化景觀帶。上述供試植物材料均由云南省農業科學院花卉研究所供給。

1.2 試驗試劑

Trizol Reagent購于Invitrogen(美國)公司；EasyPure Plant RNA Kit試劑盒和TransZol Plant試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司；水飽和酚、三氯甲烷、異戊醇，異丙醇，無水乙醇，瓊脂糖，4×TBE緩沖液、RNase-free水、DEPC(Diethypyrocarbonate, 焦碳酸二乙酯)等均購于昆明云科生物技術有限公司。

1.3 主要儀器

臺式冷凍離心機、NanoDrop 2000超微量分光光度計購于美國Thermo Scientific公司；渦旋振蕩器購于上海利聞科學儀器有限公司；壓力蒸汽滅菌器購于上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；電子天秤購于德國Sartorius公司；電泳儀、凝膠成像系統購于美國Bio-Rad公司；超純水機購于南京賽飛生物科技有限公司；制冰機購于深圳市伊雪商用制冷設備有限公司。

1.4 RNA提取

Trizol 法、EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法和TransZol Plant試劑盒法均分別參照各試劑(盒)附帶說明書進行操作。RNA提取所用的研缽、鑷子、量筒、三角瓶等凡是接觸RNA的非一次性器材和工具皆用0.1的DEPC水37 ℃過夜處理后高壓滅菌并烘干使用，離心管、槍頭等一次性耗材全部選用專用于RNA試驗的耗材。RNA的溶解、稀釋及75 %乙醇的配制均使用RNase-free水。

1.5 RNA純度及濃度檢測

通過超微量分光光度計對采用Trizol法、EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法和TransZol Plant試劑盒法3種方法分別提取得到的鳶尾植物花蕾組織總RNA的濃度及純度進行檢測(檢測前先以RNase-free水作空白對照進行調零)，并記錄各RNA樣品的濃度，以及所對應的OD260/OD280的比值和OD260/OD230的比值。

1.6 RNA完整性檢測

各取2 μl提取得到的RNA樣品，加入1.5 μl的2×RNA Loading Buffer混勻后，在80 ～ 100 V電壓條件下，經1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳30 min。電泳結束，通過凝膠成像系統檢查RNA的完整性。

2 結果與分析

2.1 總RNA純度及濃度比較

品質優良的RNA，其OD260/OD280的比值應為1.8 ～ 2.1，OD260/OD230的比值應當大于2.0[24]。當其OD260/OD280所得出的數據小于1.8時，意味著提取的RNA中含有較多的污染。這種污染可能來自于蛋白質或其它的有機物。當其OD260/OD280的數據大于2.2時，說明RNA已經部分降解[25]。若其OD260/OD230數據小于2.0，則說明提取的RNA中也有污染[26]，這種污染可能來自蛋白質、鹽類或次生代謝物。

由表1可知，對于冷凍的西南鳶尾花蕾組織，僅TransZol Plant 試劑盒法提取的RNA基本符合要求，但RNA中依然含有鹽類、蛋白質等雜質。Trizol 法和EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法提取的RNA，OD260/OD280、OD260/OD230值都很低，蛋白質和鹽分殘留多，不適于冷凍的西南鳶尾花蕾組織 RNA 的提取；對于新鮮的鳶尾花蕾，供試的3種方法提取出的總RNA的OD260/OD230值均小于2.0，表明存在一定雜質，但其OD260/OD280的比值都在1. 7～2. 2，表明3種方法獲得的RNA結構都較為完整，并未明顯降解。在RNA的純度上，3種提取方法高低排序依次為EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法>Trizol法>TransZol Plant試劑盒法，RNA的濃度上，依次為TransZol Plant試劑盒法>EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法>Trizol法。

表1 3種方法提取的冷凍西南鳶尾和新鮮鳶尾的花蕾組織總RNA質量濃度和純度對比Table 1 Comparison of RNA concentration and purity of fresh I. tectorum Maxim.buds and frozen I. bulleyana Dykes buds extracted by three different methods

2.2 RNA 完整性比較

3種不同方法(試劑)提取出的新鮮鳶尾花蕾的RNA 各取2 μl進行瓊脂糖凝膠電泳，結果均能跑出條帶，且較為清晰，亮度較高(圖1)。Trizol法和TransZol Plant試劑盒法提取的RNA樣品，點樣孔顯示明亮殘余物質(圖1)，說明仍有蛋白質殘留。3種方法所提的RNA條帶均有彌散征象，有明顯的拖尾現象，說明RNA在提取過程當中存在一定的降解。

冷凍的西南鳶尾花蕾RNA樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，TransZol Plant 試劑盒法提取的RNA樣品在電泳時有條帶出現(圖2,TZ1～TZ8)，而Trizol法和EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法提取的RNA樣品在電泳時無條帶出現(圖2,T1～T4,EP1～EP4)。TransZol Plant試劑盒法提取出的RNA，點樣孔偶有亮點(圖2,TZ1、TZ4、TZ6、TZ7)，意味著該法也未能將蛋白質等雜質完全去除，但相較于其它2種方法，TransZol Plant 試劑盒法提取的RNA條帶清楚、亮度高，結果較好。

2.3 3種總RNA提取方法的優缺點比較

由表2可見，對于新鮮的鳶尾花蕾，EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法提取的 RNA 純度和濃度均較高，能夠滿足后續分子生物學試驗的需求，且操作耗時較短，但提取試劑價格3者中最高。Trizol法提取的RNA的純度比較高，但獲得的RNA產量低，提取操作費時，試劑價錢也較貴，不推薦選用。TransZol Plant試劑盒法提取的RNA，其純度較低，但產量很高，操作簡便快捷，且價錢較低。可結合要求，在需要很高純度的RNA時選用EasyPure Plant RNA Kit試劑盒，基本滿足后續試驗即可但RNA的需求量較大時則選用TransZol Plant試劑盒。對冷凍的西南鳶尾花蕾組織，使用TransZol Plant試劑盒提取的RNA濃度高，品質較好，就能滿足后續試驗的需求，且操作耗時短，價格較低，可優先推薦使用；而用 Trizol 法和EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法提取 RNA的濃度和純度均不理想，不適合用于后續實驗，且操作時間較長，費用較高，不宜推薦使用。

表2 3種總RNA方法提取方法優缺點比較Table 2 Comparison of advantages and disadvantages of RNA extracted by three methods

3 討 論

用Trizol搭配三氯甲烷、水飽和酚(酸性)、異戊醇、異丙醇等試劑使用，從液氮研磨過的植物材料中提取RNA的方法，在現階段最為常用[28]。但本研究結果顯示，無論對于冷凍的還是新鮮的鳶尾植物花蕾組織，Trizol 法提取得到的RNA的效果都不是很理想，究其原因，可能與鳶尾屬植物花蕾中含有的較多的多糖、酚類及色素等物質有關，這些物質在RNA的提取過程中會產生干擾，而Trizol 法無法完全阻止它們的干擾作用[27]。加之Trizol試劑價格較高，操作復雜費時，因此不宜用于鳶尾植物花器官組織RNA的提取。

TransZol Plant試劑盒法能夠成功提取RNA，所依據原理是改良過的CTAB(Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide, 十六烷基三甲基溴化銨)法[29]。試劑內含有能夠結合酚類物質的PVP(Polyvinylpyrrolidone, 聚乙烯基吡咯烷酮)和防止酚類物質氧化的β-巰基乙醇，二者均可在一定程度上減弱酚類物質對RNA提取的影響[24]。提取過程中搭配三氯甲烷、異戊醇等試劑，并聯合離心操作可以很好的去除蛋白質和脂肪。因此，應用TransZol Plant試劑盒法提取出的RNA，其產量和純度一般都較高。本試驗結果顯示：在3種方法中，盡管TransZol Plant試劑盒法提取出的RNA純度并不是最好的(對于新鮮的鳶尾花蕾材料而言)，且無法完全避免雜質的污染，但即使是冷凍的植物材料對RNA的提取影響也不大，得到的RNA的產量和品質也相對較穩定。另外，應用該試劑盒提取RNA耗時較短，且試劑盒價格較低，比較經濟實用。對需要大量RNA但對RNA的質量要求不是很高的試驗可采用此法。

EasyPure Plant RNA Kit試劑盒采取柱式純化的方法完成RNA的提取，操作步驟比較簡捷。根據本試驗研究結果，EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法較適用于新鮮植物花器官組織總RNA的提取，而不適用于冷凍留存的植物材料。因其價格較高，在需要高質量的RNA且可獲得新鮮的植物材料時可考慮使用。

4 結 論

根據植物材料類型(新鮮或冷凍)、對RNA 純度和產量的要求、試劑費用及操作過程繁簡程度等綜合因素考慮，TransZol Plant 試劑盒法更適合在需要大量RNA但對RNA的質量要求不是很高時使用，且對于新鮮、冷凍的鳶尾植物花朵都較適合；EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法適合于需求高質量的RNA且有新鮮的植物材料時使用；Trizol法則不太適用于鳶尾花蕾RNA的提取。本研究結果為鳶尾屬植物后續的分子生物學研究工作提供一定前期基礎，也為其它植物花朵總RNA的提取提供參考。