馬鈴薯StDRO2基因的生物信息學(xué)分析

李葵秀，羅崇玉，傅琪景，李立池，李有春，羅 浩， 姚寶林，劉長寧，張紅驥，于德才*，杜云龍

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國際農(nóng)業(yè)研究所，云南 昆明 650205；3.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶植物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 景洪 666303；4.云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；5.農(nóng)業(yè)生物多樣性應(yīng)用技術(shù)國家工程研究中心，云南 昆明 650201)

【研究意義】植物的根是植物從土壤中吸收水分和養(yǎng)分、固著、繁殖、貯存、合成有機(jī)物質(zhì)的重要營養(yǎng)器官[1]。IGT基因家族與植物的分蘗分支角度密切相關(guān)，DRO1屬于其中的一員，其它還包括LAZY1、TILLERANGLECONTROL1(TAC1)等基因[2]。【前人研究進(jìn)展】LAZY1基因在水稻[3]、擬南芥[4]、玉米[5]、沙柳[6]中都有報(bào)道。在水稻中，因?yàn)長AZY1基因的突變導(dǎo)致生長素極性運(yùn)輸增強(qiáng)，從而改變了內(nèi)源IAA在地上部分中的分布，進(jìn)而引起對重力的不敏感性，導(dǎo)致分蘗期與成熟期分蘗角度增大[7]；擬南芥中有6個(gè)LAZY基因，分別為AtLAZY1-AtLAZY6，并定位于擬南芥的不同組織器官中，發(fā)揮的功能也不盡相同，其中atlazy2,3,4三突變體影響側(cè)根的正常生長發(fā)育[8-9]。Dong等研究發(fā)現(xiàn)，玉米lazy1突變體增加了生長素的極性運(yùn)輸[5]。在擬南芥中TAC1與LAZY1基因突變體植株的表型相反[11]。Dardick等發(fā)現(xiàn)，雙子葉植物擬南芥attac1突變體的側(cè)腋生長角度比野生型更小[12]。在桃樹中發(fā)現(xiàn)PpeTAC1過表達(dá)株系樹枝的分支角度較大，PpeTAC1-RNAi株系樹枝分支角度較小，樹形結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)緊密型[13]。DRO1基因最初發(fā)現(xiàn)是一個(gè)控制根生長角度的數(shù)量性狀位點(diǎn)，在根分生組織周圍表達(dá)[14]。在Kinandang Patong水稻中，DRO1基因首次被克隆，發(fā)現(xiàn)該基因受生長素的負(fù)調(diào)控[15]，通過改變水稻根系生長角度而影響根系的形態(tài)建成，并調(diào)控水稻的產(chǎn)量[16]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，AtDRO1主要在根維管系統(tǒng)和根尖中以不同的發(fā)育模式表達(dá)[2]。與水稻中的DRO1基因相比，具有76 %相似性的小麥的DRO1基因也表現(xiàn)出相似的功能，它可改變根系統(tǒng)的建成以響應(yīng)干旱脅迫[17]。qSOR1是DRO1同源基因，調(diào)控水稻根生長角度(RGA)，使水稻具有較淺根生長角進(jìn)而可以提高鹽堿地水稻產(chǎn)量，還發(fā)現(xiàn)qSOR1也受到生長素的負(fù)調(diào)控[18]。梁文君等已開展了馬鈴薯中StDRO1對脅迫響應(yīng)的研究[19]，但其同源基因和功能尚不清楚?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著中國馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的不斷深入，馬鈴薯已逐漸成為中國的又一主要糧食作物，在全球各地均有廣泛栽培[20-22]。馬鈴薯是一種主要收獲塊莖的農(nóng)作物，但其根系較淺，根系結(jié)構(gòu)狹窄，具有較弱的土壤穿透能力，因此對干旱脅迫較為敏感[23-25]。和谷物相比較，對于馬鈴薯根系生長發(fā)育的研究較少。然而改良根系構(gòu)型，也是提高作物抗旱能力的一種途徑[26]。馬鈴薯DRO2基因同屬于IGT基因家族，其成員DRO1、LAZY1及TAC1都參與了水稻、擬南芥及玉米的植物形態(tài)發(fā)育，尤其是對構(gòu)型的影響，而馬鈴薯DRO2的研究還未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究對馬鈴薯中的StDRO2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步開展該基因在馬鈴薯根系發(fā)育及抗旱中的功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)供試馬鈴薯品種為麗薯6號(hào)。在MS培養(yǎng)基(MS 4.74 g·L-1，蔗糖 30 g·L-1，瓊脂 7.2 g·L-1，pH 5.8)上生長20 d的苗，按2 cm左右剪下莖段(至少帶1個(gè)腋芽)，正向插入擴(kuò)繁培養(yǎng)基上，在組培室(2000 lx、12 h光照/12 h黑暗、24 ℃條件下)培養(yǎng)，3 ～ 4 d即可生根長芽，于第4天將長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)至含有0.01 μmol·L-1NAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對照組為含有等量二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)的MS培養(yǎng)基，5 d后，觀察根系發(fā)育情況。

1.2 StDRO2基因篩選及生物信息學(xué)分析

基于蛋白質(zhì)序列的相似性，通過已公布的水稻DRO1、擬南芥AtDRO1、AtDRO2、AtDRO3以及小麥、番茄，馬鈴薯中DRO1的氨基酸序列作為參照進(jìn)行了BLASTp，得到馬鈴薯StDRO1的同源基因，涉及的馬鈴薯、番茄基因組數(shù)據(jù)下載自茄科物種基因組測序數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net/)。水稻、擬南芥、小麥相關(guān)基因組數(shù)據(jù)下載自NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

利用Expasy(http://www.expasy.ch/tools)在線生物信息學(xué)工具對其進(jìn)行理化性質(zhì)分析。采用CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析。通過DNAMAN軟件進(jìn)行同源比對。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)進(jìn)行motif預(yù)測。運(yùn)用Mega5.1軟件的ClusX功能進(jìn)行同源序列比對，采用最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹。分別通過ChloroP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)、TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMH MM/,http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、跨膜區(qū)、信號(hào)肽預(yù)測。通過SOMPA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sop ma.html) 在線軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.3 馬鈴薯RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

對9 d馬鈴薯幼苗的根、莖、葉材料提取RNA，方法依據(jù)植物RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))。對提取的馬鈴薯總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)液的配制：5 μl Total RNA，4 μl 5×TransScript?All-in-One SuperMix for qPCR(北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))，1 μl gDNA Remover，10 μl RNase-free Water。反應(yīng)液配制完成后，置于42 ℃金屬浴上孵育15 min；85 ℃保溫15 s，合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 StDRO2實(shí)時(shí)熒光定量分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析馬鈴薯中StDRO2基因的表達(dá)量，具體反應(yīng)體系如下：以0.5 μl的cDNA為模板，加入5 μl的PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(Thermo Fisger Scientific公司生產(chǎn))，0.4 μl的正向引物(StDRO2-FP:5′-GAAGACATTGTTC TGCAG CG-3′)和0.4 μl的反向引物(StDRO2-RP:5′-CCTTGGACTGCTTGCTTGAG-3′)，并加入3.7 μl的ddH2O配置成10 μl的反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性45 s；56 ℃退火30 s；40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。以馬鈴薯actin基因?yàn)閮?nèi)參基因(Stactin-FP: 5′- GGTATTGTGCTGGATTCTGG-3′，Stactin-RP: 5′-CGTTCAGCACTAGTGGTGAA-3′)。進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，以2-△△Ct算法計(jì)算差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯中StDRO2基因的序列比對及其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

為了研究馬鈴薯中StDRO2基因，基于氨基酸序列的相似性，通過已公布的水稻DRO1、擬南芥AtDRO1、AtDRO2、AtDRO3、小麥的3個(gè)DRO1基因編碼的氨基酸序列作為參照進(jìn)行了BLAST，結(jié)果均能比對到同一個(gè)馬鈴薯的候選基因(PGSC0003DMG400016036)，該序列與馬鈴薯StDRO1的氨基酸序列相似性27.4 % (表1)。通過序列分析，該基因可能為馬鈴薯的StDRO1的同源基因，將其命名為StDRO2(GeneBank no.MW350102)。

利用在線軟件ProtParam(http://www.expasy.ch/tools)初步分析了馬鈴薯StDRO2蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。結(jié)果所示，包括馬鈴薯StDRO2蛋白在內(nèi)的13個(gè)DRO1蛋白及其同源物的大小有所差異，相對分子量為19 682.45～33 714.95，理論等電點(diǎn)值為4.97～9.10(表2)。不同物種中的DRO1蛋白及其同源物均屬于親水性蛋白，但穩(wěn)定性有所不同。

2.2 馬鈴薯StDRO2的亞細(xì)胞定位分析

利用CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)在線軟件對馬鈴薯StDRO2蛋白序列進(jìn)行分析，預(yù)測馬鈴薯StDRO2蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示馬鈴薯StDRO2蛋白與其它DRO1蛋白質(zhì)一樣都定位于細(xì)胞核(表3)。

2.3 馬鈴薯StDRO2蛋白質(zhì)同源比對及保守結(jié)構(gòu)域分析

通過DNAMAN軟件對DRO1蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，提取其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示馬鈴薯的StDRO2蛋白也具有一個(gè)非常保守的IGT結(jié)構(gòu)域，并包含幾個(gè)相對保守的短蛋白基序。

2.4 馬鈴薯StDRO2蛋白質(zhì)motif分析

通過MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線工具對水稻、擬南芥、小麥、番茄、馬鈴薯中DRO1蛋白及StDRO2的motif進(jìn)行分析。分析選用5個(gè)motifs，所有的蛋白都含有以IGT氨基酸序列為特征的motif 2基序，結(jié)果顯示馬鈴薯StDRO2蛋白為IGT家族成員。

表1 DRO1同源基因的分析結(jié)果

表2 馬鈴薯StDRO2蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

2.5 馬鈴薯StDRO2蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

依據(jù)水稻和擬南芥DRO1的氨基酸序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對獲得來自禾本科，茄科和十字花科的玉米、高粱、小米、二穗短柄草、煙草、亞麻薺和蘿卜的DRO1同源序列。利用MEGA5.1軟件對這些物種的蛋白序列進(jìn)行多序列比對，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示馬鈴薯和二穗短柄草在同一進(jìn)化枝上，和小米、玉米、高粱的親緣關(guān)系較近(圖3)。

2.6 馬鈴薯StDRO2蛋白葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽的分析

通過ChloroP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)、TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)分析，僅有小麥中3個(gè)DRO1蛋白有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的切割位點(diǎn)，包括馬鈴薯StDRO2在內(nèi)的13 個(gè)蛋白序列均無信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域。

表3 馬鈴薯StDRO2蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

2.7 馬鈴薯StDRO2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測

馬鈴薯StDRO2及其它物種的DRO1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)均含有無規(guī)則卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈結(jié)構(gòu)，其中，無規(guī)則卷曲數(shù)量占比最高，α-螺旋占比次之，β-折疊占比最低 (表5)，二級(jí)結(jié)構(gòu)在所有物種中具有相似的位置(圖4)。

2.8 馬鈴薯StDRO2基因表達(dá)譜

為了分析馬鈴薯中StDRO2基因的表達(dá)情況，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測到幼苗期馬鈴薯葉片中StDRO2的表達(dá)量極顯著高于根中的表達(dá)量，莖桿中的StDRO2基因表達(dá)量最低，且顯著低于根中StDRO2表達(dá)量(圖5)。

表4 馬鈴薯StDRO2蛋白葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽的分析

為了探究生長素對馬鈴薯StDRO2基因的調(diào)控作用，用0.01 μmol·L-1的NAA處理馬鈴薯材料。與對照相比，可以明顯看出低濃度NAA處理后，馬鈴薯幼苗的根毛明顯減少。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)NAA處理后的馬鈴薯根中StDRO2基因的表達(dá)量顯著低于對照(圖6)，說明生長素負(fù)調(diào)控馬鈴薯StDRO2基因的表達(dá)水平。

表5 馬鈴薯StDRO2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

續(xù)表5 Continued table 5

3 討 論

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，植株具有更深的根系則有利于獲得下層土壤中的水份及營養(yǎng)成分。根系構(gòu)型決定了根區(qū)的大小，對植物從土壤中獲得水分和養(yǎng)分的面積影響最大。通過蛋白質(zhì)序列的相似性和結(jié)構(gòu)域的分析，馬鈴薯StDRO2和其它作物中DRO1蛋白均具有IGT基因家族的保守結(jié)構(gòu)域，IGT基因家族有著較低的序列保守性[27-28]。對DRO1基因及StDRO2序列保守性的分析顯示出相對較低的保守性，這些相對保守的結(jié)構(gòu)域可能是StDRO2蛋白完成生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

擬南芥AtDRO1通過自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)時(shí)，該蛋白定位于根尖，并可以在細(xì)胞核中檢測到[29]。有研究表明，DRO1在水稻原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)時(shí)，其定位在質(zhì)膜(PM)上[15]。與此結(jié)果一致的是，DRO1的C末端保守的14 個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)域(CCL)缺失時(shí)，DRO1仍定位到質(zhì)膜上[29]。Dong等對玉米LAZY1蛋白(ZmLA1)進(jìn)行研究，通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)法(BiFC)，發(fā)現(xiàn)ZmLA1與細(xì)胞核內(nèi)的IAA17和質(zhì)膜上的PKC相互作用[10]。當(dāng)預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域(包含保守的IGT基序)被刪除時(shí)，ZmLA1就不能與PKC相互作用[10]，蛋白質(zhì)之間的相互作用顯示了DRO1或LAZY1在細(xì)胞核和質(zhì)膜上定位的分子機(jī)制。在該項(xiàng)研究中，馬鈴薯StDRO2與不同作物中的13個(gè)DRO1蛋白質(zhì)經(jīng)預(yù)測都可定位于細(xì)胞核(表3)，說明馬鈴薯的StDRO2可能作為核蛋白調(diào)控基因功能。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)功能的基礎(chǔ)，馬鈴薯StDRO2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測均含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析，馬鈴薯StDRO2蛋白質(zhì)和二穗短柄草DRO1(BRADI_4g31290)[2,30]在同一進(jìn)化枝上，和小米DRO1(SETIT_030919mg)、玉米DRO1(GRMZM2G700200)[2,30]、高粱DRO1(SORBI_3002G215300)[2,26]的親緣關(guān)系較近，這暗示馬鈴薯的StDRO2與這些作物的DRO1基因具有相同的功能。

生長素是根系發(fā)育的重要調(diào)控因子，通過合成、運(yùn)輸、信號(hào)通路等影響著植物對外界環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制，從而使得植物正常生長發(fā)育[31-32]。已有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)水稻的DRO1處于生長素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游，其轉(zhuǎn)錄水平受到生長素的負(fù)調(diào)控[15]。在該項(xiàng)研究中，NAA處理馬鈴薯幼苗后，根中StDRO2的表達(dá)水平下調(diào)。馬鈴薯StDRO2的表達(dá)受生長素的調(diào)控，StDRO2是否參與調(diào)控根系構(gòu)型還需要進(jìn)一步深入的研究。同時(shí)，該項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯StDRO2基因的表達(dá)水平在根中相比葉中并不顯著(圖6)，StDRO2在根中的低表達(dá)量與馬鈴薯抗旱能力是否存在相關(guān)性還需深入分析。本項(xiàng)研究工作為深入分析馬鈴薯StDRO2基因功能及開展深根抗旱馬鈴薯分子育種提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

馬鈴薯StDRO2基因?qū)儆贗GT基因家族中的一員，編碼親水性不穩(wěn)定蛋白，定位在細(xì)胞核，StDRO2蛋白質(zhì)均具有無規(guī)則卷曲、α-螺旋、β-旋轉(zhuǎn)角和延伸鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)，具有與已知作物的DRO1同源基因相似的分子特性，其表達(dá)水平受到生長素的負(fù)調(diào)控。