多油辣木PKM-1卡那霉素耐受性研究

張 慧，黃蘇南，杜建武，王 韋，楊鉞戈，羅 瓊，曾千春*

(1.云南農業大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學 云南辣木研究所，云南 昆明 650201；3.云南農業大學省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201)

【研究意義】多油辣木(Moringaoleifera)為辣木科Moringaceae，辣木屬Moringa，多年生喬木。原產于印度北部喜馬拉雅山南麓，是一種熱帶、亞熱帶多功能植物[1-2]。多油辣木營養豐富，在印度有近千年食用史[3]。近年從多油辣木中選育出來的新品種PKM-1，由于干熱生態區種植時蟲害較為嚴重，其推廣及生產應用受到限制。【前人研究進展】隨著基因工程技術的發展，轉基因技術已廣泛應用于提高作物抗蟲性[4]。在植物轉基因的初步檢測中，篩選劑主要分為2大類：抗生素類和氨基酸類，在抗生素類中，卡那霉素是目前植物遺傳轉化中應用最廣泛篩選劑之一[5]。為了提高篩選效率，遺傳轉化中，確定合適的抗生素篩選濃度是其重要環節。卡那霉素是一種蛋白質生物合成抑制劑，通過干擾植物細胞中葉綠體及線粒體的蛋白質合成，引起植物綠色器官的黃化，最終導致植物細胞的死亡[6]。因此，卡那霉素以其選擇效率高、副作用小及成本較低等優點被廣泛應用于雙子葉植物遺傳轉化中。【本研究切入點】目前，已報道利用卡那霉素進行篩選的植物超過50個屬，其中包含棉花[7]、桑樹[8]、番木瓜[9]、橡膠[10]等雙子葉植物，以及玉米[11-12]等極少數單子葉植物。雖然有學者開始對多油辣木PKM-1組織培養進行探索[13-14]，但辣木遺傳轉化相關研究迄今未見報道。【擬解決的關鍵問題】分析多油辣木無菌苗上胚軸、嫩葉以及由上胚軸誘導的愈傷組織在增殖階段及其愈傷組織分化階段，對5種卡那霉素濃度的耐受性，確定nptII為篩選標記遺傳轉化多油辣木PKM-1時，愈傷組織階段和分化植株階段合適的卡那霉素篩選濃度，為辣木遺傳轉化時卡那霉素篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

多油辣木PKM-1種籽由云南省元江縣依江風辣木產業開發有限公司提供。主要器材：超凈工作臺(SW-CJ-2D，上海希而科有限公司制造)，高壓滅菌鍋(MLS-3780，日本三洋公司制造)，光照培養箱(LRH-70，上海一恒科學儀器有限公司制造)，電子分析天平等(LRH-70，上海一恒科學儀器有限公司制造)。主要試劑：卡那霉素、1/2 MS培養基、蔗糖、瓊脂、6-BA、NAA。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 萌發培養基為1/2 MS，不添加激素；愈傷組織誘導培養基為1/2 MS，添加6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1；分化培養基為MS，添加6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1。所有培養基附加蔗糖3 %，瓊脂0.6 %，pH值調節至5.5～6.0，0.1～0.15 kP，121 ℃滅菌20 min。所有激素在超凈工作臺內過濾滅菌，再添加于滅菌后的培養基中，充分搖勻分裝于組培瓶中。

1.2.2 辣木無菌苗的獲得 選取籽粒飽滿的辣木籽，于超凈臺中剝去種殼，用75 %酒精消毒10 s，倒去酒精，再用20 %次氯酸鈉震蕩消毒5 min，無菌水沖洗3～5次，種仁置于無菌濾紙上吸去水分，接種于萌發培養基中，每瓶4粒。(25±2)℃，光照12 h/d，弱光照培養10 d左右即可得到株高3～5 cm的無菌苗。

1.2.3 卡那霉素耐受性試驗 設上胚軸和嫩葉誘導愈傷組織時卡那霉素濃度梯度：0、30、50、70、90、110 mg·L-1，愈傷組織分化植株時卡那霉素濃度梯度：0、10、20、30、40、50 mg·L-1，在超凈工作臺中，滅菌后的培養基冷卻至60 ℃左右時加入卡那霉素，充分搖勻，分裝于培養皿中。取生長良好的PKM-1無菌苗上胚軸與嫩葉，分別接種于前述卡那霉素濃度梯度的愈傷組織誘導培養基中，(25±2)℃，遮光培養，每20 d繼代1次，30 d后統計出愈率和死亡率。取上胚軸誘導的愈傷組織，分別接種于不同濃度卡那霉素的分化培養基中，(25±2)℃，每天光照12 h，弱光照培養30 d后統計死亡率。試驗重復3次。外植體膨大至接種時2倍視為產生愈傷組織，未膨大和褐化定為死亡。“-”愈傷組織直徑小于等于0.5 cm；“+”愈傷組織直徑為0.5～1.0 cm；“++”愈傷組織直徑為1.0～1.5 cm；“+++”愈傷組織直徑大于等于1.5 cm，同時按下式統計出愈率、死亡率。

出愈率(%)=出愈外植體數/接種外植體總數×100

死亡率(%)=外植體死亡數/接種外植體總數×100

1.3 數據處理

采用SPSS軟件對數據進行統計和顯著性檢驗等分析。

2 結果與分析

2.1 卡那霉素對PKM-1上胚軸誘導愈傷組織的影響

由圖1和表1可知，與對照相比，添加卡那霉素的培養基對上胚軸誘導愈傷組織均具有一定的抑制作用。上胚軸誘導的愈傷組織誘導率均低于對照，且隨著卡那霉素濃度的提高，出愈率逐漸降低，死亡率迅速上升。對照培養10 d左右即可誘導出淡綠、較緊實的愈傷組織(圖2-A)。卡那霉素30 mg·L-1時，出愈率80.00 %，極顯著低于對照94.82 %；卡那霉素50 mg·L-1時，上胚軸細胞團膨大變緩，出愈率下降為49.63 %，與其他處理呈極顯著差異；卡那霉素70 mg·L-1時，細胞團膨大明顯受到抑制，外植體呈黃褐色，出愈率為20.74 %，與其他組別間呈極顯著差異；卡那霉素90和110 mg·L-1時，上胚軸不膨大，未誘導出愈傷組織，且逐漸死亡。可見，PKM-1上胚軸誘導愈傷組織階段的卡那霉素耐受濃度為50～70 mg·L-1。

表1 不同卡那霉素濃度對PKM-1愈傷組織誘導和分化植株的影響

2.2 卡那霉素對PKM-1嫩葉誘導愈傷組織的影響

與對照相比，添加卡那霉素的培養基對嫩葉誘導愈傷組織均具有一定的抑制作用(圖3)。由表1可知，嫩葉愈傷組織誘導率均低于對照，且隨著卡那霉素濃度的提高，出愈率逐漸降低，死亡率迅速上升。對照培養30 d左右，嫩葉卷曲膨大，葉表面或葉緣處形成淡綠色愈傷組織，且愈傷組織緊實，有小顆粒狀突起(圖2-B)，出愈率為93.33 %。卡那霉素30 mg·L-1時，嫩葉膨大變緩，出愈率為70.37 %，極顯著低于對照；50 mg·L-1卡那霉素時，嫩葉膨大受到嚴重抑制，出愈率28.89 %，與其他處理呈極顯著差異；卡那霉素70 mg·L-1時，嫩葉無卷曲膨大，且逐漸褪綠變白，出愈率為6.67 %，極顯著低于對照、30 mg·L-1處理和50 mg·L-1處理；卡那霉素90和110 mg·L-1時，嫩葉褪綠變白的比例也逐步提高，無愈傷組織形成。因此，PKM-1嫩葉誘導愈傷組織階段的卡那霉素耐受濃度為30～50 mg·L-1。

2.3 卡那霉素對PKM-1愈傷組織分化植株的影響

與對照相比，添加卡那霉素的培養基對愈傷組織分化植株均具有一定的抑制作用(圖4)。由表1可知，愈傷組織分化植株增殖均低于對照，且隨著卡那霉素濃度的提高，愈傷組織增殖變差，死亡率上升。培養30 d，對照愈傷組織緊實，顏色深綠，表面有小顆粒狀突起，且增殖良好(圖2-C)，死亡率為19.26 %；卡那霉素10 mg·L-1時，愈傷組織增殖開始受到抑制，死亡率為30.56 %，極顯著高于對照；20 mg·L-1卡那霉素時，愈傷組織增殖受到較嚴重影響，死亡率上升為40.74 %；卡那霉素30 mg·L-1時，愈傷組織基本不增殖，死亡率上升為95.56 %，與對照、10和20 mg·L-1組別呈極顯著差異；卡那霉素40和50 mg·L-1時，愈傷組織完全死亡。因此，PKM-1愈傷組織分化植株時卡那霉素耐受性是20～30 mg·L-1。

3 討 論

植物基因工程中，愈傷組織誘導和分化植株階段的卡那霉素耐受性存在較大差異[15-17]。楸樹組培苗生根培養時卡那霉素耐受濃度為100～150 mg·L-1，濃度低于100 mg·L-1時部分莖段干枯，少部分為綠，濃度為150 mg·L-1以上時，極少上部為綠，且基部干枯[15]；無菌苗嫩葉卡那霉素篩選濃度為40 mg·L-1，低于30 mg·L-1時，嫩葉會產生愈傷組織，提高濃度至40 mg·L-1時，嫩葉大量褐化，無愈傷組織形成[16]；在山葡萄葉柄愈傷組織分化時，20 mg·L-1的卡那霉素濃度已開始抑制愈傷組織分化植株，提高濃度至30 mg·L-1時，未分化的愈傷組織幾乎不能生長，故將篩選濃度定為20 mg·L-1[17]。通過試驗，辣木PKM-1上胚軸誘導愈傷組織的卡那霉素耐受濃度為50～70 mg·L-1，過低則篩選效果不明顯，過高則會完全抑制愈傷組織的誘導；嫩葉誘導愈傷組織的卡那霉素耐受濃度為30～50 mg·L-1，嫩葉膨大受抑制，但仍可誘導出部分愈傷組織；愈傷組織分化植株的卡那霉素耐受濃度為20～30 mg·L-1，此時愈傷組織增殖變緩，但不會完全被抑制。

試驗過程中注意到，添加卡那霉素的培養基中，隨著濃度的增加，上胚軸細胞團膨大逐漸變緩，出愈率降低，部分上胚軸失水，逐漸褐化直至死亡，歐陽樂軍等[18]在抗生素對尾巨桉誘導愈傷組織試驗中也發現外植體失水褐化情況。嫩葉誘導愈傷組織過程中，隨著卡那霉素濃度提高，嫩葉膨大受抑制，出愈率下降，褪綠變白的比例也逐漸升高。耿天龍[19]等也觀察到金發草的愈傷組織對卡那霉素敏感性很強，當卡那霉素濃度為10 mg·L-1時，金發草愈傷組織的生長和分化受到明顯抑制，并出現大量白化苗。

4 結 論

多油辣木PKM-1愈傷組織分化階段較之愈傷組織增殖階段對卡那霉素更敏感。多油辣木PKM-1上胚軸的卡那霉素篩選濃度宜為70 mg·L-1，葉片誘導愈傷階段為50 mg·L-1，愈傷組織分化階段為30 mg·L-1。這些結果為應用nptII作為篩選標記基因，開展多油辣木抗蟲轉基因研究，采用卡那霉素篩選提供了基礎和參考。