乙酰膽堿對鹽脅迫下煙草懸浮細胞生理特性的影響

鄧金華，郭曉琳，黃金輝, 張永鋒，李淑娥，鄭 璽，劉 祥，葉愛萍，穆耀輝，王平平，張立新*

(1. 西北農林科技大學生命科學學院， 陜西 楊凌 712100；2. 陜西省煙草公司商洛市公司, 陜西 商洛 726000；3. 陜西省煙草科學研究所, 陜西 西安 710077)

【研究意義】土壤鹽漬化是我國和全球共同面臨的環境問題，現代農業中，鹽脅迫已經成為限制農作物生產的主要威脅之一[1]。土壤中高濃度的鹽分會使植物產生鹽離子毒害、氧化脅迫和滲透脅迫等[2]，導致植物生長發育遲緩、光合作用下降，甚至造成植物死亡[3-4]。因而，植物的耐鹽機理和如何提高植物的耐鹽性始終是植物生理學和農學所關注的重點問題[5]。高濃度的NaCl是鹽脅迫形成的主要原因[6]。因此在研究植物耐鹽性機理時，也主要集中于NaCl脅迫下植物的生理學響應以及植物對NaCl脅迫的抵抗作用[5]?！厩叭搜芯窟M展】乙酰膽堿(ACh，acetylcholine)是動物細胞中常見的一種神經遞質。1914年，Ewins[7]首次在非動物細胞麥角菌中發現了乙酰膽堿，此后，科學家們陸續在各植物體內也發現了乙酰膽堿的存在[8]。現已證實乙酰膽堿在多種高等植物體內均有分布，但不同種屬的不同器官，其相對含量存在較大差異[9]。科學家對乙酰膽堿在植物內的生理作用研究發現，乙酰膽堿對植物生長發育，以及調控植物抗逆性等方面起著重要作用。Yamamoto等[10]研究報道了玉米 AChE 過表達的轉基因煙草植株的耐熱性與非轉基因煙草植株相比顯著增強，表明了乙酰膽堿酯酶(AChE)對玉米耐熱性具有積極作用。Braga等[11]研究表明，在滲透脅迫下乙酰膽堿可以促進大豆幼苗生長和干物質積累。然而，關于乙酰膽堿對植物耐鹽性調節作用的相關研究還是較為缺乏?！颈狙芯壳腥朦c】煙草(Nicotianabenthamiana)是目前研究中使用最為廣泛的模式植物之一，也是重要的經濟作物。煙草生長迅速，且它的DNA序列簡單，易被操縱，因此煙草已被廣泛用于耐鹽脅迫的研究中，其耐鹽脅迫的機制和有關的耐鹽基因已有了比較完備的研究體系[12]。然而，比起土壤中的復雜環境條件，懸浮細胞具生長周期短，細胞群體個體均一，環境簡單易控等優點，能更加科學、直接的體現細胞對耐鹽脅迫生理機制的影響?！緮M解決的關鍵問題】本試驗選用以本氏煙葉片為材料建立懸浮細胞系，探究外源乙酰膽堿對NaCl脅迫下對煙草細胞生理生化特別是滲透調節和抗氧化代謝的影響，旨在為乙酰膽堿在提高植物耐鹽性的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草材料為本氏煙草，種子由本課題組繁育所得，試驗于西北農林科技大學生命科學學院理科樓D418實驗室及大型儀器平臺進行。乙酰膽堿購于楊凌天成化玻站。愈傷組織誘導培養基：MS+NAA 1.0 mg/L +6-BA 0.5 mg/L +蔗糖30 g/L +瓊脂15 g/L。

1.2 煙草愈傷組織、懸浮細胞培養體系的建立

1.2.1 本氏煙植株的培養 選取完整飽滿的本氏煙草種子，水浸3～4 d，取已露白的種子種于育苗盆中，種子間保持約1 cm的間距，保持土壤濕潤。置于26.5 ℃光照培養箱中培養，培養四周后，選取部分幼苗的葉片進行組織培養，誘導愈傷組織。

1.2.2 愈傷組織的誘導和培養 葉片消毒：選取長勢良好的本氏煙植株，用手術剪剪取幼嫩葉片，剪成邊長為5 mm的正方形。清水沖去表面灰塵。在已紫外滅菌的超凈臺中進行后續滅菌接種操作。70 %乙醇消毒30 s后，用鑷子將葉片加入1 %次氯酸鈉中消毒5 min，無菌水漂洗4～5次后用無菌濾紙吸干水分，轉入愈傷組織誘導培養基中。

恒溫培養：于室溫28 ℃，光照12 h/d條件下的組織培養間培養。約35 d后，獲得質地疏松，生長旺盛的淡黃色愈傷組織。

1.2.3 懸浮細胞系的建立與繼代培養 選取白色疏松的愈傷組織夾散后接種于MS液體培養基中，每升3 g。調pH為6.8，高溫高壓滅菌。26 ℃，140 r/min搖床黑暗條件下振蕩培養，繼代周期為 8 d。繼代2次，新舊培養基的比例為10∶1。在超凈臺中操作，每次操作時用5 mL移液槍輕輕吹打，使細胞懸浮均勻分布于培養基中，吸取5 mL懸浮細胞接種于50 mL的新培養基中。

1.3 試驗設計

按照預試驗篩選出的脅迫鹽濃度(50 mmol/L NaCl)和ACh濃度(10 μmol/L)進行細胞培養，按表1加入試劑，調節培養基pH=6.8。每組5個重復，培養5 d后測定相應指標。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 細胞形態觀察 采用伊文斯藍(Evans Blue)染色法對細胞形態進行觀察。吸取10 mL懸浮細胞于離心管中，8000 r/min，離心10 min。去除多余培養液，用pH 7.8的PBS清洗，離心后去除多余緩沖液，再加入新鮮的PBS，重復3次，離心后去除PBS，加入1 mL的0.05 %的伊文斯藍染色液，25 ℃染色10～15 min。PBS清洗2～3次后用1 mL PBS重懸細胞。吸取10 μl滴于載玻片上，制片。顯微鏡20倍鏡觀察。

1.4.2 細胞核形態觀察 采用DAPI染色法對細胞進行染色處理，熒光顯微鏡GFP觀察。在經磷酸緩沖液處理后的細胞懸液中加入DAPI染色液5 mL，終濃度為5 μg/mL。30 ℃黑暗條件下孵育1 d，PBS洗去多余染液，熒光顯微鏡觀察。

表1 試驗處理方式

1.4.3 端粒酶活性測定 按細胞∶PBS=1∶9的比例研磨，4 ℃ 8000 r/min離心取上清，加樣、溫育、洗滌5次，加酶標試劑后重復溫育洗滌操作，加顯色試劑顯色后終止反應。酶標儀450 nm下測各孔的OD，計算端粒酶活性。

1.4.4 可溶性蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍 G-250 染色法[13]測定可溶性蛋白含量。

1.4.5 脯氨酸(Pro)含量測定 使用茚三酮法測定Pro含量。在懸浮細胞中加入3 %的磺基水楊酸，沸水浴提取脯氨酸，取2 mL提取液，分別加入2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮，沸水浴30 min，冷卻后加入4 mL甲苯，充分震蕩。靜置后取上層液。以甲苯為對照對照，測A520吸光值，計算脯氨酸含量。

1.4.6 丙二醛(MDA)含量測定 采用TBA法[13]測定丙二醛(MDA)含量。

1.4.7 抗氧化保護酶類活性測定 采用NBT光還原法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性；紫外光吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性；愈創木酚比色法測定過氧化物酶(POD)活性[13]。

1.5 數據統計分析

使用 Excel 2019 進行數據統計和繪圖，使用SPSS 25.0 進行數據分析處理，用 Duncan’s 新復極差法進行差異顯著性檢驗(P=0.05)。

2 結果與分析

2.1 外源乙酰膽堿對懸浮細胞生長的影響

2.1.1 伊文斯藍染色細胞形態觀察 細胞形態是鑒定細胞受損情況和細胞活性的重要特征之一。如圖1所示，對照(CK)和10 μmol/L ACh處理下的細胞能明顯看出伊文斯藍染色劑未能穿過細胞膜進入到細胞體內，整體呈現淺藍色，不能觀察到細胞核。50 mmol/L NaC(鹽脅迫組)l處理下的細胞被染為深藍色，可以看到細胞核，細胞核形態皺縮，染色質收縮。出現有細胞碎片。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh處理下的細胞有破損，染色不均，出現死亡細胞有一些細胞可以看到被染色的細胞核，細胞核發生皺縮但比50 mmol/L NaCl處理的染色質濃縮程度弱，整體染色比對照深，比鹽脅迫組要淺。說明ACh對煙草細胞在鹽脅迫下維持細胞形態具有一定的增強作用。

2.1.2 DAPI染色細胞核形態觀察 在鹽脅迫條件下，植物細胞的細胞核的形狀會有不同程度的變化，細胞質凝集，細胞會出現凋亡狀態。且鹽脅迫導致的細胞內活性氧等物質的積累也有會對核膜造成一定程度的損傷。從圖2-a中可以看出CK組的細胞核是規則圓形，顏色均一，發出藍色熒光，亮度較強。在圖2-b中10 μmol/L ACh組的細胞核亮度暗，但形態規則呈圓形。50 mmol/L NaCl處理的細胞核體積小，拉伸變形，染色不均，應為染色質濃縮DNA分布不均導致，亮度暗，周圍有藍色熒光圍在核的四周，可能是由于細胞核內物質外泄所致。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh處理的細胞核發生形變，呈不規則的橢圓形，染色不均勻，其形變比50 mmol/L NaCl處理的細胞核程度要淺。說明ACh可以一定程度緩解鹽脅迫條件對細胞核的損傷。

2.1.3 外源乙酰膽堿對端粒酶活性的影響 端粒酶是一種反轉錄酶，它可以延長端粒序列，保護染色體末端序列不被分解。在動物細胞中的研究證明[14]，端粒酶可以修復細胞凋亡所導致的DNA損傷。植物細胞在凋亡過程中也會發生與動物細胞類似的過程，因此端粒酶活性與維持逆境下細胞DNA的完整性有密切關聯。從圖3可見，10 μmol/L ACh處理的端粒酶活性最高，表明在正常環境下外源ACh對煙草細胞中端粒酶活性有一定的增強作用，但是差異不顯著。而在鹽脅迫條件下，50 mmol/L NaCl處理比CK組降低了33.1 %，說明在鹽脅迫環境會導致細胞端粒酶活性降低，使得細胞染色體受損。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh處理的細胞端粒酶活性是50 mmol/L NaCl處理的1.47倍，與對照組的端粒酶活性差異不顯著。表明ACh對保護端粒酶，維持端粒酶活性方面有重要作用。ACh可以通過提高端粒酶活性來緩解鹽脅迫對DNA造成的損傷，保護染色體從而減少細胞凋亡。

2.2 外源乙酰膽堿對懸浮細胞滲透調節的影響

2.2.1 外源乙酰膽堿對細胞內可溶性蛋白含量的影響 由圖4分析所得，10 μmol/L ACh處理的細胞內可溶性蛋白含量較對照(CK組)處理增加了18.1 %，但差異不顯著。而50 mmol/L NaCl 處理的細胞內可溶性蛋白含量顯著下降，較CK組降低了28.4 %。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh處理下的可溶性蛋白含量較NaCl處理顯著增加，提高了49.3 %。綜合分析可得，在鹽脅迫條件下，細胞內可溶性蛋白質下降，細胞的滲透調節能力降低，通過添加外源ACh可以顯著增加煙草細胞中可溶性蛋白含量，對植物的滲透調節具有積極的作用。

2.2.2 外源乙酰膽堿對細胞內脯氨酸(Pro)積累的影響 如圖5所示，10 μmol/L ACh處理的細胞內脯氨酸含量較對照組略有提高，但差異不顯著。50 mmol/L NaCl處理的Pro含量與CK組相比差異顯著，減少了63.39 %。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh 處理的細胞內Pro含量較50 mmol/L NaCl處理顯著提高，約增加了一倍，但相較于對照組，還存在顯著的差異。綜合分析，在鹽脅迫條件下，細胞中Pro含量會顯著下降，從而影響煙草細胞的滲透調節，通過添加外源乙酰膽堿，可以部分緩解高濃度NaCl導致的滲透脅迫。

2.3 外源乙酰膽堿對懸浮細胞抗氧化特性的影響

2.3.1 外源乙酰膽堿對細胞丙二醛(MDA)積累的影響 MDA使細胞膜脂過氧化的最終分解產物，其含量代表著氧化脅迫對細胞膜脂質雙分子層過氧化的程度[15]。由圖6可以得出，正常生理條件下(CK組)的MDA含量較少，而10 μmol/L ACh處理的細胞中MDA含量積累減少，比對照降低了14.8 %，但差異不顯著。50 mmol/L NaCl處理模擬鹽脅迫的細胞內MDA的積累量顯著增加，比CK組增加了121.8 %。而50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh 處理的細胞中MDA含量比CK組增加了43 %，差異不顯著；較50 mmol/L NaCl處理減少了35.3 %，差異顯著。表明在鹽脅迫的環境下，會使細胞產生氧化脅迫，導致MDA的濃度升高，通過添加外源ACh能顯著減少MDA，從而有效的保護細胞膜系統不被過氧化損傷。

2.3.2 外源乙酰膽堿對SOD活性的影響 由圖7可見，10 μmol/L ACh處理的細胞內SOD活性較CK組差異不顯著。在鹽脅迫環境下(50 mmol/L NaCl處理)的細胞內SOD活性較對照組顯著降低，比CK組降低了56.5 %。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh 處理的細胞內SOD活性較50 mmol/L NaCl處理顯著增加，其SOD活性為50 mmol/L NaCl處理的2.07倍，且與CK組差異不顯著。綜合表明，外源ACh可以提高鹽脅迫下煙草細胞內的SOD活性。

2.3.3 外源乙酰膽堿對CAT活性的影響 如圖8所示，10 μmol/L ACh處理的細胞內CAT酶活性與CK組沒有顯著差異。50 mmol/L NaCl處理的CAT活性較CK組顯著降低，僅為CK組的35.47 %。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh 處理的CAT活性較50 mmol/L NaCl處理顯著提高；但與對照組也有顯著差別，為CK組的79.78 %。綜合分析可知，鹽脅迫會降低細胞內CAT活性，而外源施加ACh可以使CAT活性接近正常細胞。

2.3.4 外源乙酰膽堿對POD活性的影響 由圖9可見，各種處理下培養5 d的煙草懸浮細胞間POD的活性變化。10 μmol/L ACh處理的POD活性與CK組之間相比無顯著差異。50 mmol/L NaCl處理的POD活性較CK組下降了37.1 %。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh處理的POD活性比50 mmol/L NaCl處理增加了27.9 %。綜合分析可知，添加外源Ach可以一定程度提高鹽脅迫下POD活性，從而減輕高鹽分導致的氧化損傷。

3 討 論

鹽脅迫會導致植物的離子失衡和高滲脅迫，進而導致植物發生氧化脅迫，其表現是多方面的，鹽脅迫會使植物中的滲透調節物質，如可溶性蛋白和脯氨酸含量減少，從而減弱植物的耐受滲透脅迫的能力；此外，鹽脅迫會使植物發生生理性失水，在水分脅迫下植物體內會產生大量的活性氧，活性氧會使細胞膜受損，加劇MDA的積累，抗氧化酶類活性下降；同時，活性氧也會使葉綠素發生降解，降低光合作用，進而碳同化反應受到抑制，這樣就導致植株生長緩慢和干物質的大量消耗，甚至死亡。大量研究表明脫落酸(ABA)、油菜素內酯(BLs)、水楊酸(SA)和褪黑素(MT)等植物激素的適當施用可能在植物鹽脅迫信號轉導和適應性調控中參與積極的作用[16-19]。乙酰膽堿是一種類似于植物激素的化學物質，但其在植物耐鹽性領域的研究較少?？扇苄缘鞍鬃鳛橐环N重要的營養物質，可以調節細胞滲透壓，保護生物膜，對植物耐鹽脅迫起重要作用[20-21]。脯氨酸是細胞內重要的小分子有機物，在細胞內常以游離形態存在。由于氨基酸的兩性特征，Pro在調節細胞內酸堿平衡中起著重要作用，因此Pro被認為是有效的有機滲透調節物質之一[22]。Pro還可以作為信號分子調節線粒體功能，影響細胞增殖或死亡[23]。本試驗條件下，施用外源ACh(10 μmol/L)可顯著提高鹽脅迫下細胞中可溶性蛋白和脯氨酸的含量，增強植物對高鹽分導致的滲透脅迫的耐受性，提高細胞的滲透調節能力。

MDA是植物受到脅迫損傷后，細胞脂質膜過氧化的產物，MDA含量可以作為脂膜過氧化的指標，間接的判斷細胞膜系統的受損程度[24]。在煙草懸浮細胞抵抗鹽脅迫環境的過程中，細胞內MDA的含量積累的越多，說明膜系統受損程度就越嚴重。植物體內存在著能清除活性氧的膜系統保護酶系，主要有超氧物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等，以維護體內活性氧代謝的平衡，保護自己免受活性氧的傷害[25]。SOD是植物抗氧化系統第一道防線[26]，SOD可以通過歧化反應消除植物由于鹽脅迫產生的大量活性氧，減輕氧化損傷[24]。SOD分解活性氧產生的過氧化氫通常由POD和CAT將其分解成對細胞無害的H2O和O2。本研究表明，乙酰膽堿(10 μmol/L)可以減少MDA的積累，提高細胞內抗氧化酶類SOD、CAT和POD的活性，增強植物的抗氧化能力。黃麗英[27]也發現褪黑素預處理可以增強鹽溶液灌根條件下黃瓜幼苗中SOD、CAT和POD的活性，顯著地降低MDA含量。說明乙酰膽堿可能也參與植物的氧化脅迫的信號轉導和適應性調控中。

本研究還發現，乙酰膽堿可一定程度緩解高鹽分對細胞的損傷，減輕染色質的收縮，增強細胞內端粒酶活性。目前，關于乙酰膽堿的研究多集中于對植物的生長、發育和代謝的調控，在逆境生理這一領域研究相對較少。本研究初步分析了乙酰膽堿對煙草細胞的在鹽脅迫下的滲透調節物質、抗氧化代謝的影響，但其作用機理和信號途徑還需做進一步研究。

4 結 論

本試驗研究了添加外源10 μmol/L的乙酰膽堿對 50 mmol/L NaCl模擬鹽脅迫條件下煙草細胞形態、滲透調節和抗氧化代謝的影響。結果表明施用一定量的乙酰膽堿可一定程度緩解高鹽分對細胞的損傷，減輕染色質的收縮；可顯著提高細胞內可溶性蛋白和脯氨酸的含量，增強植物在鹽脅迫下的滲透調節能力；還可以提高鹽脅迫下細胞內抗氧化酶類SOD、CAT和POD的活性，增強植物的抗氧化能力。綜合表明，ACh對提高植物的耐鹽性起著一定的作用。