沉默Orai1通過調控內質網應激抑制急性腦梗死大鼠海馬神經元凋亡①

李 航 熊 波 文遠超 張 剛

（遵義市第一人民醫院，遵義醫科大學第三附屬醫院神經外科，遵義563000）

腦梗死（cerebral infarction，CI）又稱缺血性卒中（cerebral ischemic stroke，CIS），是導致老齡人群致殘和死亡的重要原因。一旦發生缺血，數小時甚至數分鐘內就會發生序慣性腦損傷，使細胞內外能量代謝平衡被打破，相關區域的血管單元功能受到影響，導致神經元細胞被損害。有研究顯示，內質網是Ca2+在細胞內儲存的主要場所，腦缺血后短時間內會造成細胞內鈣超載，使內質網的生理功能紊亂，引發內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［1-2］。ERS發生時原本存在于內質網上的Ca2+大量轉移到細胞漿，在此過程中會使鈣依賴相關的降解酶被激活而使細胞膜結構破壞，最終造成細胞凋亡的發生［3］。有研究表明，鈣釋放激活鈣通道調節分子1（calcium release-activated calcium modulator 1，Orai1）缺失介導的Ca2+內流障礙對急性CIS有神經保護作用，但其具體機制不詳［4］。同時也有研究表明，在細胞靜息狀態下，STIM1和Orai1蛋白分別分布于內質網和細胞膜上，但當細胞內鈣庫耗竭時，二者在內質網-細胞膜結構上形成功能性鈣離子釋放激活鈣通道（Ca2+release-activated calcium chan?nel，CRAC），促使細胞外內流Ca2+，導致細胞內鈣超載，引起內質網應激并介導神經元凋亡［5］。本研究擬通過注射Orai1干擾慢病毒下調急性CI大鼠腦缺血區組織中Orai1基因表達，觀察其對腦神經功能的保護作用，探討其可能作用機制，為心腦血管疾病防治提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠60只，鼠齡6～7周，體重（220±20）g，由湖北省動物實驗中心提供，動物合格證編號：SCXK（鄂）2018-0031。溫度為24℃，濕度為50%，通風良好，明暗光照交替12 h，標準飼料喂養，自由進食及飲水。2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，貨號T8877）購自美國Sigma公司；實時定量PCR試劑盒、Furo-3/AM、BCA試劑盒和TUNEL凋亡檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；Orai1、間質相互作用分子1（STIM1）、Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、同源蛋白（CHOP）、葡萄糖調節蛋白78（GRP78）、肌醇酶-1（IRE-1）、Caspase-12和GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；HRP標記的羊抗兔或小鼠IgG抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；Orai1慢病毒shRNA干擾質粒載體、陰性對照慢病毒質粒載體的構建以及慢病毒包裝、濃縮和純化均由漢恒生物科技（上海）有限公司完成，shRNA-Orai1特異性序列為F：5′-AGAAACACACTCTTTGGCAdTdT-3′；R：5′-AATGCT?GTCACCTCGCdTdT-3′。

1.2 方法

1.2.1 模型構建與分組處理 60只SPF級雄性SD大鼠，適應性飼養1周后，隨機分成4組，即假手術組（sham）、模型組（model）、Orai1干擾組（shRNAOrai1）、陰性對照組（shRNA-NC），15只/組。腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，采用改良Longa線栓法制作急性CI大鼠模型［6］。術前24 h，shRNA-Orai1組和shRNA-NC組大鼠采用立體定位經側腦室（前囟后1 mm，旁開1.5 mm，深3.5 mm）分別注射0.2 ml Orai1 shRNA干擾慢病毒（shRNA-Orai1）溶液及其陰性對照慢病毒（shRNA-NC）溶液，注射過程中保持緩慢、勻速并及時關注大鼠呼吸節律以避免產生腦疝，慢病毒滴度為2×108TU/ml，sham組和model組大鼠分別注射等量生理鹽水。

1.2.2 神經功能缺損評分 各組大鼠于造模24 h后，采用Zea-Longa五級評分法評估神經功能［7］，評分越高代表神經功能損傷越嚴重，具體評分標準：0分，狀態正常；1分，輕度神經功能缺失，不能完全伸展左前肢；2分，中度神經功能缺失，向左側轉圈；3分，中度神經功能缺失，向左側傾倒；4分，無意識，不能自發行走。

1.2.3 TTC法評估大鼠腦梗死面積 造模24 h后，在每組隨機挑選5只大鼠處死并取腦，剔除小腦和低位腦干后迅速放入-20℃冰箱，20 min后取出并切片，保持切片厚度為2～3μm，隨后使用2%TTC液染色，37℃避光染色25 min后可觀察到梗死區域呈白色。拍照并使用ImagePro Plus 6圖像分析軟件計算CI百分比。CI面積百分比（%）=CI組織總面積/腦組織面積×100%。

1.2.4 熒光探針法檢測大鼠海馬組織內Ca2+濃度 造模24 h后，斷頭處死，取腦并分離出海馬，將海馬剪成漿狀后使用胰酶消化制備成單細胞懸液，然后用Furo-3/AM熒光探針（4 mol/L）負載45 min，最后使用熒光分光光度計檢測細胞內Ca2+濃度［8］。

1.2.5 TUNEL染色檢測大鼠海馬組織神經元凋亡 造模24 h后，斷頭處死取腦，剝離大鼠大腦并分離出海馬組織，洗凈后用10%甲醛固定24 h后脫水處理，常規石蠟包埋，制作3～4μm石蠟切片，采用脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TU?NEL）標記凋亡的神經元。海馬CA1區神經元呈線型緊密有序排列，且細胞核明顯，細胞體積偏大，顯微鏡下觀察并統計神經元凋亡細胞數。神經細胞凋亡率（%）=TUNEL陽性細胞數/總細胞數×100%

1.2.6 qRT-PCR檢測大鼠海馬組織中Orai1的mRNA表達 收集各組大鼠海馬組織，按照Trizol試劑盒說明書提取樣本總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA濃度。用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉為cD?NA，并以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增。Orai1引物序列，F：5′-TGGCCGTGCACCTGTTC-3′，R：5′-TTGCTCACAGCCTCGATGTT-3′；GAPDH引 物 序列，F：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′，R：5′-CCACAGTCCGCCATCACT-3′。反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸45 s，共40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算Orai1的mRNA相對表達量。

1.2.7 Western blot檢測大鼠海馬組織中相關蛋白表達 收集各組大鼠海馬組織，加入適量RIPA裂解液，冰上充分裂解30 min，4℃條件下12 000 r/min離心20 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。取20μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，并將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉30 min，分別加入一抗稀釋液（Orai1、STIM1、Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、CHOP、GRP78、IRE-1、Caspase-12、GAPDH，1：1 000），4℃孵育過夜。次日，洗膜后加入HRP標記的羊抗兔或小鼠IgG（1：20 000），室溫孵育1 h，洗膜，滴加化學發光試劑，于暗室顯影分析。以GAPDH為內參計算各蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析 所有數據均采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分 如圖1所示，與sham組相比，model組大鼠神經功能評分升高（P＜0.01）；與model組和shRNA-NC組相比，shRNAOrai1組大鼠神經功能評分降低（P＜0.01）。

2.2 各組大鼠CI面積 如圖2所示，sham組大鼠無CI面積，其他各組大鼠均出現CI面積。與model組和shRNA-NC組相比，shRNA-Orai1組大鼠CI面積比例降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠海馬組織Ca2+濃度 如圖3所示，與sham組相比，model組大鼠海馬組織中Ca2+濃度升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與model組和shR?NA-NC組相比，shRNA-Orai1組大鼠海馬組織中Ca2+濃度降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠神經功能缺損評分比較Fig.1 Comparison of neurological scores in each group

圖2 各組大鼠腦梗死面積比較Fig.2 Comparison of brain infarct area in each group

圖3 各組大鼠海馬組織Ca2+濃度比較Fig.3 Comparison of Ca2+concentration in hippocampal tissues of rats in each group

2.4 各組大鼠海馬神經元凋亡水平 如圖4、5所示，與sham組相比，model組大鼠海馬組織神經元凋亡率及凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Bax表達水平均升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與model組和shRNA-NC組相比，shRNA-Orai1組大鼠海馬組織神經元凋亡率及Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

2.5 各組大鼠海馬組織中Orai1 mRNA及其蛋白表達 如圖6所示，與sham組相比，model組大鼠海馬組織中Orai1 mRNA及蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與model組和shRNA-NC組相比，shRNA-Orai1組大鼠海馬組織中Orai1 mRNA及蛋白表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.6 各組大鼠海馬組織中STIM1蛋白表達 如圖7所示，與sham組相比，model組大鼠海馬組織中STIM1蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與model組和shRNA-NC組相比，shRNAOrai1組大鼠海馬組織中STIM1蛋白表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.7 各組大鼠海馬組織中內質網應激相關蛋白CHOP、GRP78、IRE-1和Caspase-12表達 如圖8所示，與sham組相比，model組大鼠海馬組織中CHOP、GRP78、IRE-1和Caspase-12蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與model組和shR?NA-NC組相比，shRNA-Orai1組大鼠海馬組織中CHOP、GRP78、IRE-1和Caspase-12蛋白表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖4 TUNEL染色（×200）Fig.4 TUNEL staining（×200）

圖5 各組大鼠海馬組織中凋亡蛋白表達比較Fig.5 Comparison of apoptotic proteins expression in hip?pocampal tissue of rats in each group

圖6 各組大鼠海馬組織中Orai1基因表達比較Fig.6 Comparison of Orai1 gene expression in hippocam?pal tissue of rats in each group

圖7 各組大鼠海馬組織中STIM 1蛋白表達比較Fig.7 Comparison of STIM 1 protein expression in hippo?campal tissue of rats in each group

圖8 各組大鼠海馬組織中內質網應激相關蛋白表達比較Fig.8 Comparison of endoplasmic reticulum stress-relat?ed proteins expression in hippocampal tissue of rats in each group

3 討論

CIS后缺血半暗帶神經元的保護及功能恢復，是臨床治療的重要靶標，也是決定臨床預后的重要因素。無論是藥物還是手術處理，實現局部血管再通、血流恢復，均有可能引起缺血半暗帶的再灌注損傷，嚴重者可進一步加重神經功能障礙。既往研究提示，氧化應激、鈣超載及興奮性毒性等因素均參與其中［9-10］。Ca2+是神經元最普遍的信號轉導分子，而鈣超載是腦缺血后導致細胞損傷最重要的一類離子失衡，Orai1通道介導的Ca2+內流障礙對急性CIS有神經保護作用［11］。本研究通過改良Longa線栓法制作急性CI大鼠模型，并干預腦組織中Orai1基因表達，結果顯示：干擾Orai1可明顯降低CI大鼠的神經功能評分、CI面積及海馬組織神經元凋亡率，同時上調海馬組織中Bcl-2蛋白表達，下調Cleaved-caspase-3和Bax蛋白表達，說明抑制Orai1基因表達可有效減輕急性CI大鼠神經損傷，具有腦保護作用。

Ca2+作為信使參與多種神經細胞功能活動的調節，而Ca2+超載是腦缺血后導致細胞損傷中最重要的一類離子失衡。當各類刺激發生時，會使海馬神經細胞中的Ca2+大量內流，造成細胞內的Ca2+超載，而Ca2+失衡會引發蛋白激酶C的持續激活，同時其持續激活會進一步促進細胞Ca2+內流，加重Ca2+超載，這兩個過程循環往復使得蛋白酶和核酸內切酶的活化及合成過程被促進，最后導致神經元功能結構的損害及細胞的凋亡［12-13］。有研究顯示，缺血后Ca2+內流是導致大鼠海馬神經元凋亡的主要原因［14］。本研究結果也顯示，模型組大鼠海馬內Ca2+濃度明顯升高，而Orai1干擾組大鼠海馬內Ca2+濃度明顯降低，說明腦缺血大鼠模型中海馬組織高表達的Orai1可誘導Ca2+大量內流造成神經元凋亡，而抑制Orai1表達可阻斷神經元凋亡的相關下游機制。

內質網是Ca2+在細胞內儲存的主要場所，當內質網膜上的鈣通道被外源性化合物誘導而發生改變時就會出現Ca2+超載或Ca2+耗竭現象，使內質網的生理功能紊亂，從而影響蛋白的合成、折疊及修飾過程，最終導致ERS的發生，進而引發細胞凋亡［15］。有研究表明，在細胞靜息狀態下，STIM1和Orai1蛋白分別分布于內質網和細胞膜上，但當細胞內鈣庫耗竭時，二者在內質網-細胞膜結構上形成功能性CRAC，促使細胞外內流Ca2+，導致細胞內鈣超載，引起ERS并介導神經元凋亡［5］。待細胞內鈣恢復后，STIM1-Orai1復合體穩定性逐漸下降，STIM1蛋白多聚體解聚，逐漸恢復至靜息狀態。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠海馬組織內STIM1和Orai1蛋白表達顯著增多，與模型組相比，Orai1干擾組大鼠海馬組織內STIM1和Orai1蛋白表達顯著減少。說明Orai1介導鈣內流，抑制Orai1可對腦缺血后神經元起保護作用，STIM1和Orai1蛋白可能是神經系統疾病替代療法的新靶點。

GRP78是內質網腔內的一種分子伴侶，是公認的內質網應激的標志性蛋白［5］。正常情況下與內質網膜上的活化轉錄因子6、肌醇激酶1（inositol-re?quiring kinase-1，IRE-1）和內質網激酶（PKR-like ER kinase，PERK）處于緊密結合狀態，都沒有活性。但當ERS發生時，GRP78會從這3種跨膜蛋白上解離出來，與未折疊或錯誤折疊的蛋白結合，恢復蛋白質的正確結構，使相關蛋白質能夠正確合成，從而保證機體內環境的平衡穩定，故GRP78的表達水平在一定程度上反映了細胞ERS保護性反應的程度［16］。活化的PERK和IRE-1可通過激活TRAF2蛋白進一步活化Caspase-12，而后活化的Caspase-12易位至細胞質，剪切Caspase-9前體產生活化的Cas?pase-9，進而激活下游凋亡蛋白Caspase-3表達，誘導細胞凋亡［17］。CHOP也是內質網應激的標志性蛋白，在非ERS狀態時，CHOP主要存在于細胞質，含量很低，在細胞發生ERS時，CHOP活化并高表達后轉移至線粒體，通過線粒體途徑使抗凋亡蛋白Bcl-2的表達被抑制，而促凋亡蛋白Caspase-3的表達被促進，最終導致細胞凋亡發生［18-19］。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織內內質網應激相關蛋白CHOP、GRP78、IRE-1和Caspase-12蛋白表達水平顯著上調，與模型組比較，Orai1干擾組大鼠海馬組織內質網應激相關蛋白表達水平顯著下調。提示急性CI能夠直接導致細胞內Ca2+穩態的調節異常，誘發ERS，進而加劇胞漿Ca2+超載，誘導細胞凋亡。

綜上所述，下調Orai1基因表達可改善急性CI大鼠神經功能，減少CI面積和神經細胞凋亡，其機制可能與平衡海馬內Ca2+的濃度，抑制內質網應激相關。