白念珠菌群體感應分子法尼醇對巨噬細胞Ana-1和RAW264.7增殖、凋亡和遷移能力的影響①

胡萬超 王 丹 朱俊峰 周子陽 唐建國

（復旦大學附屬上海市第五人民醫院急危重癥醫學科，上海200240）

白念珠菌是一種常寄居于人體呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道的條件致病菌，免疫缺陷個體中，白念珠菌可穿過宿主保護膜定植于內臟器官引發感染，甚至危及生命［1-3］。白念珠菌分為菌絲相和酵母相，其致病狀態主要是菌絲相，菌絲相形成的生物膜可固定于固體表面，易于其定植與侵襲，且與耐藥性密切相關［4-7］。法尼醇是白念珠菌生成的群體感應分子，可抑制白念珠菌酵母相向菌絲相轉換，從而抑制生物膜形成［8-9］。研究發現，法尼醇聯合氟康唑可協同抑制生物膜形成，在降低白念珠菌耐藥性方面有廣闊應用前景［10-12］。法尼醇也可通過促進ROS產生和破壞線粒體誘導哺乳動物、真菌和細菌細胞凋亡［13］。但其生物學機制尚未闡明。

宿主抵抗白念珠菌定植及侵襲過程中，機體固有免疫和適應性免疫發揮重要作用［14-15］。巨噬細胞在固有免疫和適應性免疫過程中均起重要作用，不僅可作為效應細胞吞噬和殺滅白念珠菌，還可作為抗原提呈細胞激活適應性免疫，誘導促炎癥細胞因子釋放，如TNF-α、IL-6等，從而誘導Th1細胞免疫反應［16-17］。研究顯示，法尼醇可增加巨噬細胞趨化，當白念珠菌被趨化的巨噬細胞吞噬3～6 h后，白念珠菌可形成菌絲穿透巨噬細胞，引發免疫逃逸［18-19］。研究發現，法尼醇可影響單核細胞、中性粒細胞、未成熟的樹突狀細胞表面標志物表達，但其對巨噬細胞的具體生物學效應尚未明確［19］。本研究在細胞水平觀察法尼醇對巨噬細胞RAW264.7和Ana-1增殖、凋亡、遷移的影響，發現法尼醇可抑制巨噬細胞增殖，促進巨噬細胞凋亡和遷移，其機制可能為法尼醇趨化巨噬細胞后，其毒性作用抑制巨噬細胞增殖的同時激活程序性凋亡通路，對進一步研究白念珠菌如何從巨噬細胞逃逸并破壞巨噬細胞具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 巨噬細胞RAW264.7和Ana-1購自中國科學院干細胞庫。

1.1.2 主要試劑 法尼醇購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITc）凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；0.22μm和0.45μm PVDF膜購自德國Millipore公司；鼠單克隆抗體β-ac?tin、兔單克隆抗體GAPDH購自美國CST公司；AKT兔單克隆抗體、P-AKT兔單克隆抗體購自英國Abcam公司；PARP兔單克隆抗體、Caspase-3兔單克隆抗體、Caspase-9兔單克隆抗體購自美國Proteintech公司；兔二抗和鼠二抗購自美國Jackson ImmunoResearch公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.1.3 主要儀器 流式細胞儀購自美國BDBiosci?ence公司；WB電泳、轉膜系統購自美國Bio-Rad公司；酶聯免疫檢測儀購自瑞士Tecan集團；倒置顯微鏡購自美國萊卡公司；超凈工作臺、離心機、超低溫冰箱、37℃培養箱均購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 RAW264.7巨噬細胞未用藥物處理前采用DMEM培養基+10%胎牛血清培養，Ana-1采用1640培養基+10%胎牛血清培養，培養條件為5%CO2、37℃，生長至80%～85%融合時，采用細胞刮刮下RAW264.7細胞，移液槍吹下Ana-1細胞，傳代2～3 d。藥物處理時采用無血清培養基培養以防止血清與法尼醇反應而影響藥物效果［20-21］。實驗分為對照組及不同濃度法尼醇處理巨噬細胞組。對照組給予1‰DMSO，實驗組給予RAW264.7和Ana-1各自半數抑制濃度（IC50）及其以下濃度法尼醇，CCK-8法檢測并計算IC50，因此處理RAW264.7巨噬細胞分為對照組、法尼醇5、15、25μmol/L組；法尼醇處理Ana-1巨噬細胞分為對照組、法尼醇5、15μmol/L。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞生長抑制率 取對數生長期RAW264.7細胞和Ana-1細胞，分別用細胞刮和吹打方式消化細胞，PBS洗滌，離心，取細胞沉淀，制備1×105個/ml單細胞懸液，100μl/孔接種至96孔板培養24 h，吸凈培養基，PBS洗滌，加入無血清培養基配制的相應濃度法尼醇，各濃度設3個復孔，繼續培養4 h，10μl/孔加入CCK-8溶液孵育3 h，酶標儀測定450 nm處各孔吸光度并計算均值。法尼醇IC50測定：不同濃度法尼醇處理巨噬細胞RAW264.7和Ana-1，觀察1 h、4 h細胞存活情況，計算細胞活性，細胞活性=（存活率實驗組-存活率空白組）/（存活率對照組-存活率空白組）×100%，GraphPad Prism8.0.2軟件計算并進行線性擬合得到IC50及相關曲線。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測 取對數生長期RAW264.7細胞和Ana-1細胞，制備5×105個/ml單細胞懸液并接種至小皿，1 ml/孔加入4 ml培養基培養24 h，PBS洗滌，按預先設置的分組給予相應濃度法尼醇繼續培養4 h，胰酶消化并收集細胞，PBS洗2次，棄上清，100μl/管加入結合緩沖液重懸細胞，加入Annexin V試劑5μl和PI試劑10μl，混勻，避光孵育15 min，流式細胞術檢測。

1.2.4 Western blot檢測 接種至小皿的各組細胞培養24 h，PBS洗滌，采用不同濃度法尼醇處理4 h，提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，30μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗3次，15 min/次，加入二抗，室溫孵育2 h，洗滌3次，ECL化學試劑發光，曝光，Image J軟件進行半定量檢測。

1.2.5 Transwell檢測 取對數生長期細胞，RAW 264.7細胞制備5×105個/ml細胞懸液，Ana-1細胞制備2×105個/ml細胞懸液，各組上室加入100μl細胞懸液，按實驗分組，下室加入由培養基（不含血清）配制的相應濃度法尼醇溶液600 ml，5%CO2、37℃培養，RAW264.7細胞培養24 h，Ana-1細胞培養72 h，4%多聚甲醛溶液固定30 min，結晶紫染色30 min，ddH2O沖洗上室內未遷移的細胞并用棉簽擦掉，自然干燥，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism8.0.2軟件進行統計學分析，數據以±s表示，兩組間比較采用Student′st檢驗，多組間比較采用完全隨機設計的單因素分析（Oneway-ANOVA），組間兩兩比較采用Dun?nett′st檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 法尼醇對RAW264.7和Ana-1巨噬細胞的IC50檢測 隨處理時間延長和濃度增加，法尼醇對RAW264.7和Ana-1巨噬細胞增殖的抑制作用越發顯著（圖1），法尼醇作用于RAW264.7巨噬細胞1 h和4 h的IC50分別為（48.95±1.49）μmol/L、（26.1±0.65）μmol/L，不同時間點IC50值差異有統計學意義（t=14.55，P＜0.05）。法尼醇作用于Ana-1巨噬細胞1 h和4 h的IC50分 別 為（23.29±0.33）μmol/L、（17.19±0.93）μmol/L，不同時間點IC50值差異有統計學意義（t=6.182，P＜0.05）。

圖1 法尼醇對巨噬細胞活性的影響Fig.1 Effect of farnesol on macrophages viability

2.2 法尼醇對RAW264.7和Ana-1巨噬細胞凋亡的影響 與對照組［（8.54±0.43）%］相比，5、15、25μmol/L法尼醇處理組RAW264.7細胞凋亡率分別 為（32.79±5.34）%、（39.32±2.42）%、（52.31±1.80）%，差異具有統計學意義（P＜0.001）。與對照組［（5.71±1.10）%］相比，5、15μmol/L法尼醇處理組Ana-1細 胞 凋 亡 率 分 別 為（17.81±1.05）%、（32.73±3.31）%，差異具有統計學意義（P＜0.001）。隨法尼醇濃度增加，作用于巨噬細胞4 h后凋亡率提高，提示法尼醇可促進巨噬細胞凋亡（圖2）。

圖2 法尼醇對巨噬細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of farnesol on apoptosis of macrophages

2.3 法尼醇對巨噬細胞凋亡相關蛋白表達的影響 不同濃度法尼醇可促進巨噬細胞凋亡，進一步檢測經典的凋亡通路AKT/BCL-2/Caspase-9/Cas?pase-3/PARP，結果顯示，與對照組相比，不同濃度法尼醇作用于RAW264.7和Ana-1巨噬細胞4 h后，隨法尼醇濃度增加，RAW264.7巨噬細胞中，僅有采用最高濃度法尼醇處理時，磷酸化AKT（P-AKT）表達明顯下降（P＜0.01）。Ana-1巨噬細胞中，隨法尼醇濃度增加，P-AKT表達下降，呈濃度依賴性，與對照組差異具有統計學意義（P＜0.01，P＜0.001）。AKT可激活Bcl-2抑制細胞凋亡，進一步檢測不同濃度法尼醇處理巨噬細胞后Bcl-2蛋白表達，2種巨噬細胞中Bcl-2表達降低，除采用5μmol/L法尼醇處理Ana-1細胞時，Bcl-2表達與對照組差異無統計學意義，其余各組差異均具有統計學意義（P＜0.01，P＜0.001，圖3）。進一步檢測促進細胞凋亡的另一經典家族Caspase家族蛋白表達，同時由于PARP蛋白作為底物既可被Bcl-2抑制，又可被Caspase蛋白剪切，故檢測PARP蛋白表達，結果如圖4所示，PARP和PARP剪切帶（Cleaved PARP）表達在2種巨噬細胞中呈相反趨勢，PARP表達逐漸減少，Cleaved PARP表達逐漸增加，與對照組差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。Caspase-9剪切帶（Cleaved Caspase-9）在RAW264.7巨噬細胞中僅有采用最大濃度（25μmol/L）法尼醇處理時表達明顯增加（P＜0.001），在Ana-1巨噬細胞中，與對照組相比，法尼醇處理組Cleaved Caspase-9表達增加（P＜0.05，P＜0.001）。Caspase-3主帶在2種巨噬細胞中的表達與法尼醇處理無關，而Cleaved Caspase-3隨法尼醇濃度增加，表達逐漸增加（P＜0.01，P＜0.001），呈劑量依賴性（圖5）。各凋亡蛋白在2種巨噬細胞中表達趨勢基本一致。

圖3 法尼醇對巨噬細胞AKT、P-AKT、Bcl-2蛋白表達的影響Fig.3 Effect of farnesol on expressions of AKT，P-AKT，Bcl-2 proteins in macrophages

圖4 法尼醇對巨噬細胞PARP、Cleaved PARP、Cleaved Caspase-9蛋白表達的影響Fig.4 Effect of farnesol on expressions of PARP，Cleaved PARP，Cleaved Caspase-9 proteins in macrophages

2.4 法尼醇對巨噬細胞遷移的影響 為研究白念珠菌分泌法尼醇后，法尼醇能否趨化巨噬細胞誘導巨噬細胞凋亡，進一步采用不同濃度法尼醇處理巨噬細胞以驗證其遷移能力，結果顯示，與對照組相比，不同濃度法尼醇可促進RAW264.7和Ana-1巨噬細胞遷移，且呈劑量依賴性，各組間差異均具有統計學意義（P＜0.01，P＜0.001，圖6）。

圖5 法尼醇對巨噬細胞Caspase-3及Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響Fig.5 Effect of farnesol on expressions of Caspase-3 and Cleaved Caspase-3 proteins in macrophages

圖6 法尼醇對巨噬細胞遷移的影響Fig.6 Effect of farnesol on migration of macrophages

3 討論

念珠菌是引起院內血流感染的第4大原因，隨抗生素、腫瘤患者及器官移植患者免疫抑制劑應用增多，白念珠菌感染增多，真菌耐藥性日趨嚴重［22］。目前臨床應用最多的抗白念珠菌藥物主要為棘白菌素類、唑類、多烯類及核苷酸類似物，但并不能完全抑制白念珠菌生物膜形成，導致白念珠菌對傳統抗真菌藥物耐藥性增加［23-26］。法尼醇作為白念珠菌分泌的群體感應分子，可抑制白念珠菌生物膜形成，與傳統抗真菌藥物聯用可減少耐藥性發生，但其對白念珠菌侵襲和感染的作用機制尚未明確。

機體抵御白念珠菌感染時，巨噬細胞在固有免疫和激活適應性免疫中起重要作用，當白念珠菌進入機體時，巨噬細胞可識別、吞噬病原體和招募其他免疫效應細胞，但白念珠菌分泌的法尼醇如何影響巨噬細胞尚未明確，本研究采用2種巨噬細胞RAW264.7和Ana-1探究法尼醇對巨噬細胞的影響。

研究顯示，白念珠菌生物膜形成可破壞巨噬細胞，巨噬細胞也可影響生物膜形成［27-28］。法尼醇可抑制生物膜形成，同時作為白念珠菌的毒力因子導致小鼠巨噬細胞活性下降，引發白念珠菌傳播［19］。本研究采用CCK-8法確定不同濃度法尼醇在不同時間處理RAW264.7和Ana-1巨噬細胞的IC50，結果發現隨時間延長，IC50逐漸降低，法尼醇處理巨噬細胞RAW264.7 4 h的IC50為25μmol/L，處理Ana-1 4 h的IC50為15μmol/L，均在白念珠菌分泌法尼醇的生理濃度范圍內（2～60μmol/L）［15，19-20］。提示白念珠菌分泌的法尼醇濃度足以抑制巨噬細胞增殖活性，因此本研究采用生理濃度的法尼醇更能反映白念珠菌和機體免疫細胞的相互作用。

巨噬細胞遷移對發揮吞噬作用具有重要作用，研究顯示，法尼醇可促進RAW264.7巨噬細胞遷移［21］。本研究采用Transwell法分析RAW264.7和Ana-1巨噬細胞遷移，發現隨生理劑量法尼醇濃度增加，巨噬細胞遷移能力增強。當白念珠菌分泌法尼醇后，可促進巨噬細胞進一步遷移接近白念珠菌，但同時法尼醇可降低巨噬細胞活性，因此課題組進一步研究法尼醇是否可通過凋亡途徑抑制巨噬細胞增殖。

細胞凋亡是細胞受基因調控的程序性死亡過程，其途徑主要包括死亡受體途徑和線粒體途徑，Bcl-2蛋白家族主要參與后者調控，作為Caspase的抑制因子抑制細胞凋亡。Bcl-2/Caspase-9/Caspase-3/PARP通路是細胞凋亡的經典途徑之一，本研究對Bcl-2蛋白的表達情況進行分析，發現隨法尼醇濃度增加，Bcl-2表達逐漸減少，而促凋亡蛋白Cas?pase-3、Caspase-9和PARP剪切帶表達均隨法尼醇濃度增加而增加，由于AKT既可通過促進Bcl-2也可以通過抑制Caspase-9抑制細胞凋亡，故檢測AKT及P-ATK蛋白表達情況，發現隨法尼醇濃度增加，PAKT表達減少，因此，法尼醇可能通過影響和激活AKT、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Cleaved PARP和PARP表達促進RAW26.7和Ana-1巨噬細胞凋亡。同時流式實驗也展現了法尼醇對巨噬細胞的凋亡作用。

巨噬細胞與白念珠菌的相互關系目前尚未闡明，正常免疫情況下，巨噬細胞可吞噬清除白念珠菌，免疫低下時，白念珠菌可借助巨噬細胞進行擴散，白念珠菌的群體感應分子法尼醇可抑制其生物膜形成，課題組研究法尼醇對巨噬細胞生物活性的影響結果顯示，法尼醇也可能通過抑制巨噬細胞生長促進巨噬細胞凋亡和遷移影響白念珠菌增殖。當白念珠菌入侵機體時，其分泌的法尼醇可趨化巨噬細胞，從而導致白念珠菌被巨噬細胞吞噬，降低巨噬細胞活性，誘導巨噬細胞凋亡，同時白念珠菌菌絲穿透巨噬細胞質膜引發免疫逃逸。因此研究法尼醇與巨噬細胞的關系可能對治療白念珠菌感染具有重要意義，其作用機制和有待進一步研究。