肺癌患者miR-21靶基因挖掘及其在血清中的表達與診斷價值①

王文棟 裴澤浩 席小雪 崔偉亮 張 彤 常曉彤（河北北方學院醫學檢驗學院，張家口075000）

肺癌嚴重危害人類健康，其發病率、死亡率均居惡性腫瘤之首［1］。隨著科學技術和精準醫學的不斷發展，肺癌治療手段有所提升。但由于大部分患者明確診斷時已發展至中晚期，手術治療效果甚微［2］。因此，尋找非侵入性、高靈敏度、高特異性的肺癌腫瘤標志物的意義重大。

有研究表明，微小RNA（microRNAs，miRNAs）的表達與肺癌的發生、發展密切相關，在肺癌腫瘤細胞的黏附、浸潤和擴散過程中發揮重要調節作用［3］。由于miRNAs在腫瘤組織和外周血液中表達相對穩定，組織特異性較高，使其在肺癌診斷和分型中的應用成為可能，具有探索價值［4］。既往研究發現，miR-21不僅在肺癌患者的腫瘤細胞中表達升高，其在外周血中表達水平也高于正常人群，與肺癌的發生、發展、轉移和預后不良有關［5］。鑒于此，miR-21可能是一種有前途的肺癌診斷和預后監測的無創標記物，但外周miR-21表達水平是否與肺癌病理分型有關目前尚無報道，且miR-21作用的分子機制尚不明確。因此，本研究擬通過生物信息學分析方法挖掘miR-21靶基因及其分子特征，然后采用實時熒光定量PCR技術（real-time fluorescence quan?titative PCR，RT-qPCR）檢測不同病理類型肺癌患者（小細胞肺癌、鱗狀上皮細胞肺癌、腺癌）與健康對照人群血清的miR-21表達水平，進行ROC（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線分析，以豐富miR-21與肺癌關聯的分子機制、探討血清miR-21對于肺癌診斷及病理分型的價值。

1 資料與方法

1.1 資料 收集中國人民解放軍第二五一醫院經病理檢查確診的肺癌患者靜脈血標本61例（含小細胞肺癌21例，腺癌18例，鱗癌22例）及該院同期正常體檢人群靜脈血標本26例。人miR-21引物套裝購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；內參U6引物購自美國Invitrogen公司；Trizol、FastQuant RTKit、SuperRe?al PreMix Plus購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌miR-21靶基因的生物信息學挖掘與分析

1.2.1.1 肺癌miR-21靶基因挖掘 利用miRe?cords數 據 庫（http：//c1.accurascience.com/miRe?cords/）［6］對人的miR-21進行靶基因預測。并用Pic?Tar、PITA、MirTarget2、RNAhybrid和TargertScanS等11個miRNA靶基因預測工具對miRecords預測結果進行驗證，保證至少被2種不同算法預測的交集作為miR-21的靶基因。再使用GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）［7］搜索獲得肺癌的相關致病基因，將致病基因與miRecords得到的靶基因取交集得到肺癌miR-21靶基因集合。

1.2.1.2 肺癌miR-21及其靶基因染色體定位 利用UCSC數據庫（http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）［8］和MapGene2Chrom web v2在線分析工具（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0）［9］對肺癌miR-21及靶基因進行染色體定位和可視化分析。

1.2.1.3 肺癌miR-21靶基因的功能注釋和STRING互作分析 利用DAVID數據庫（Visualiza?tion，Annotation and Integrated Analysis，https：//da?vid.ncifcrf.gov）［10］采用全新的模糊聚類算法，將肺癌miR-21靶基因關聯到生物學功能注釋上，找出最顯著富集的生物學功能注釋（P-value≤0.05和Count≥4 genes），有利于對肺癌進行關聯性研究分析。聯合使用STRING11.0在線分析工具（https：//stringdb.org/）［11］和Cytoscape 3.6.1軟 件［12］構 建 肺 癌miR-21靶基因編碼產物蛋白的互作網絡，篩選出重要的中心節點蛋白。

1.2.2 肺癌血清miR-21表達水平檢測和診斷肺癌效能評估

1.2.2.1 RT-qPCR Trizol法提取樣本血清總RNA。TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit進行逆轉錄反應。逆轉錄反應總體系為10μl，分別加入10×Fast RTBuffer 2μl、U6 Reverse Primer 2μl、RNase-Free ddH2O 3μl、microRNA-21 Stem Loop Primer 2μl和RT Enzyme 1μl（即用即溶）。RT-qP?CR每個樣本做3個復孔，miRNA反應體系為20μl：2×Super Real Premix Plus 10μl（終濃度為1×）、miR-21 PCR Primer Set（包含上下游引物）0.8μl、RNase-Free ddH2O 8.2μl和cDNA模板1μl。內參基因U6的反應體系為20μl：2×Super Real Premix Plus 10μl（終濃度為1×）、U6 Forward Primer 0.6μl、U6 Re?verse Primer 0.6μl、RNase-Free ddH2O 7.8μl和cD?NA模板1μl。設置PCR反應模式，進行PCR擴增（反應模式：95℃，3 min；95℃，12 s；62℃，40 s；共40個循環）。記錄各管Ct值，復孔間Ct值之差＞0.5，需重復實驗。

1.2.2.2 數據處理 以U6為內參基因，加入待測血清，實現目標基因均一化處理。待測血清miR-21的相對表達量公式：RQ=2-??Ct。RQ＜1，則肺癌患者血清中目的基因表達水平高于正常人群目的基因表達水平；反之，則肺癌患者血清中目的基因表達水平低于正常人群目的基因表達水平。?Ct=CtTarget-CtReference（CtTarget代表待測樣本目標基因Ct值均值；CtReference代表待測樣本內參基因Ct值均值）。肺癌患者與正常人群血清目的基因表達水平變化比較公式：RQ=2-??Ct；??Ct=（CtTarget-CtReference）肺癌組-（CtTarget-CtReference）正常組。

1.3 統計學分析 對miR-21的相對表達水平（2-??Ct）進行對數轉換，轉換后數據符合正態分布。數據以±s表示，采用SPSS19.0軟件分析。統計方法為獨立樣本t檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌miR-21靶基因 使用miRecords數據庫得到至少被2種不同算法預測且經過實驗驗證的miR-21靶基因共計30個。利用GeneCards數據庫獲取肺癌相關致病基因共計22 367個，將此22 397個致病基因與上述30個miR-21靶基因做交集，發現30個miR-21靶基因均存在于肺癌發病相關基因集合中，由此篩選到肺癌miR-21靶基因共計30個，分別為：腫瘤抑制因子原肌球蛋白1（TPM1）、核因子IB（NFIB）、細胞程序性凋亡蛋白4（PDCD4）、ser?pin家族B成員5（SERPINB5）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（CDKN1A）、細胞表面凋亡受體（FAS）、代謝調節信號分子C（FAM3C）、同源結構域相互作用蛋白激酶3（HIPK3）、跨膜γ羧基酸蛋白4（PRRG4）、肌動蛋白α2（ACTA2）、抗增殖因子2（BTG2）、2型骨形態發生蛋白受體（BMPR2）、雌激素家族1（SESN1）、白介素受體6（IL6R）、細胞因子信號傳導抑制因子5（SOCS5）、糖皮質激素1（GLC?CI1）、凋亡肽酶激活因子1（APAF1）、溶質載體家族16成員10（SLC16A10）、血清/糖皮質激素調節激酶家族成員3（SGK3）、半胱氨酸胞外蛋白質2（RP2）、細胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）、肌動蛋白結合蛋白2（CFL2）、富含半胱氨酸的胞外蛋白質（RECK）、金屬肽酶抑制劑3（TIMP3）、甲硫腺苷磷酸化酶（MTAP）、SRY-box轉錄因子5（SOX5）、磷酸酶張力蛋白同源物（PTEN）、轉移因子1（E2F1）、轉化生長因子β受體2（TGFBR2）和細胞分裂周期25A（CDC25A），見圖1。提示miR-21在肺癌的發生、發展過程中可能起重要作用。

圖1 肺癌miR-21靶基因Fig.1 miR-21 target genesin lung cancer

2.2 染色體定位 利用UCSC數據庫和Map?Gene2Chrom web v2在線分析工具對肺癌miR-21及其靶基因進行染色體定位和可視化分析，miR-21位于人類17q23.1染色體，具體位置為chr17：59，841，266-59，841，337，長度22 bp。肺癌miR-21靶基因在染色體分布如圖2。

圖2 肺癌miR-21及其靶基因染色體定位Fig.2 Chromosomal localization of miR-21 and its target genes in lung cancer

圖3 肺癌miR-21靶基因功能注釋圖Fig.3 Functional annotation map of miR-21 target genes in lung cancer

2.3 靶基因功能注釋和互作網絡 利用DAVID數據庫將肺癌miR-21靶基因關聯到生物學功能注釋上，最顯著富集的生物學功能注釋（P-value≤0.05和Count≥4 genes）見圖3，包括：regulation of cell prolif?eration（細胞增殖調節，含SGK3，TGFBR2，BM?PR2，FAS4個基因）、protein phosphorylation（蛋白質磷酸化，含GK3，HIPK3，TGFBR2，CDK6 4個基因）、protein kinase binding（蛋白激酶結合，含E2F1，AC?TA2，PTEN，CDC25A 4個基因）、protein binding（蛋白 質 綁 定 功 能，含RECK，E2F1，SGK3，FAM3C，RP2，TGFBR2，BMPR2，SOX5，CDK6，IL6R，SOCS5，TPM1，SESN1，PDCD4，TIMP3，PTEN，CDC25A，CD?KN1A，BTG2，SERPINB5，CFL2，MTAP，FAS，APAF1共計24個基因）、negative regulation of cell prolifera?tion（細胞增殖負調控，含CDKN1A，BTG2，CDK6，PTEN 4個基因）、negative regulation of apoptotic pro?cess（細胞凋亡負調控，含CDKN1A，HIPK3，FAS，PTEN，PDCD4 5個基因）、extracellular exosome（胞外，含BTG2，ACTA2，SERPINB5，FAM3C，CFL2，RP2，MTAP，APAF1，FAS，TIMP3共計10個基因）、cytosol（細胞液，含SGK3，ACTA2，TGFBR2，CDK6，TPM1，PDCD4，PTEN，SESN1，CDC25A，CDKN1A，BTG2，MTAP，APAF1，FAS共計14個基因）、cyto?plasm（細胞質，含ACTA2，SERPINB5，HIPK3，RP2，BMPR2，MTAP，CDK6，FAS，GLCCI1，SOCS5，SESN1，PTEN，PDCD4，CDC25A共計14個基因）、ATP binding（ATP結合，含SGK3，ACTA2，HIPK3，TGFBR2，BMPR2，CDK6，APAF1 7個基因）、apoptot?ic process（細胞 凋亡過程，含HIPK3，TGFBR2，APAF1，FAS，PTEN，PDCD4 6個基因），miRNA-21靶基因主要分布在細胞外，參與細胞凋亡、細胞增殖的調控過程、具有與ATP和蛋白質結合的功能，miRNA-21靶基因的異常表達可能與癌癥的發生密切相關。

圖4 肺癌miR-21靶基因互作網絡圖Fig.4 Interaction network of miR-21 target genes in lung cancer

圖5 血清miRNA-21表達水平和ROC曲線Fig.5 Expression level and ROC curves of miRNA-21 in serum

利用STRING11.0在線分析工具和Cytoscape 3.6.1軟件構建了肺癌miR-21靶基因編碼產物蛋白的互作網絡，發現有24個靶基因，分別為PTEN，PDCD4，CDKN1A，TIMP3，SERPINB5，CDK6，RECK，TPM1，BTG2，CDC25A，E2F1，APAF1，ACTA2，TGF?BR2，FAS，SESN1，HIPK3，SGK3，PRRG4，GLCCI1，NFIB，FAM3C，CFL2和MTAP之間存在蛋白互作關系，其中PTEN、PDCD4和CDKN1A為關鍵的、重要的中心節點蛋白（圖4）。

2.4 血清miR-21的表達與診斷價值評估 提取的總RNA OD260/OD280為1.8～2.1可用于進一步檢測。miR-21及U6內參均能實現特異性擴增，溶解曲線為單峰，具有特異性，實驗結果可靠。血清miR-21在肺癌患者血清中的表達水平遠高于正常人群（圖5A），差異有統計學意義（P＜0.001）；各型肺癌相比（圖5B），腺癌患者血清miR-21的表達水平顯著高于小細胞肺癌與鱗癌患者（P＜0.05），而后兩者之間無差異（P＞0.05）。根據各型肺癌患者血清miR-21擴增數據，繪制受試者ROC曲線，直觀反映其診斷價值。血清miR-21診斷肺癌（圖5C）、小細胞肺癌（圖5D）、非小細胞肺癌（圖5E）、鱗狀上皮細胞肺癌（圖5F）、腺癌（圖5G）的AUC分別為0.915、0.879、0.934、0.911、0.962，見表1。使用Medcalc軟件，根據ROC曲線，獲得血清miR-21診斷肺癌及不同病理類型肺癌的臨界值、靈敏度和特異性（表2）。

表1 各型肺癌患者血清miR-21的診斷效能Tab.1 Diagnostic efficacy of serum miR-21 in patients with various types of lung cancer

表2 血清miR-21對于肺癌診斷及其病理分型的價值Tab.2 Value of serum miR-21 for diagnosis and pathological type of lung cancer

3 討論

惡性腫瘤的診斷是現代醫療和精準醫學的研究熱點，引起廣泛關注。實現無創早期準確診斷，能夠明顯延長患者生存期，并降低其死亡率。mi-RNAs通過與靶mRNA的3'端非翻譯區結合，誘導靶mRNA降解或抑制其翻譯，從轉錄后水平調控基因表達。自發現miR-Lin4至今，人類基因組中發現的miRNAs基因已達2 500個以上，在細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程的調節中發揮重要作用［13］。

人類miR-21位于人類染色體17q23.1，其靶基因主要分布在1、2、3、6、7、8、9、10、11、12、14、15、17、18、20、22和X染色體上，而在5、13、16、19、21和Y染色體上沒有肺癌關聯的miR-21靶基因。有研究表明miR-21的異常表達與實體腫瘤密切相關，可能通過下調腫瘤抑制因子原肌球蛋白1（TPM1）、骨形態發生蛋白（BMP）通路相關基因、TCF21-KISS1基因、p53基因、細胞程序性凋亡蛋白4（PDCD4）促進腫瘤細胞增殖，抵抗細胞分化凋亡，發揮癌基因功能［14-19］。本研究獲得的miR-21靶基因中，APAF1、FAS、GLCCI1、IL6R、NFIB和SOX5與細胞凋亡、分化過程有關，miR-21可能通過調控這些基因抵抗細胞凋亡分化，引發癌變；BTG2、CDC25A、CDK6、CD?KN1A、E2F1、SGK3、TGFBR2和TIMP3作為細胞周期的監測點，控制細胞周期的正常過度，miR-21可通過調控這些基因促進細胞增殖；ACTA2、BMPR2、CFL2和TPM1參與肌絲肌球蛋白的合成，miR-21可通過調控這些基因進行微絲微管生成的調節，進而影響細胞分裂過程；FAM3C被鑒定為上皮-間質轉化和轉移進展的新型調節劑，可用于區分臨床早期患者的預后［20］。有研究表明miR-21參與非小細胞肺癌上皮-間充質轉化狀態的自分泌和旁分泌回路［21］；HIPK3在癌癥組織和細胞系中表達不同，在癌癥細胞生長，轉移和血管生成中起雙重作用，可能是癌癥治療的潛在靶標［22］；MTAP具有腫瘤抑制活性，該基因編碼一種在多胺代謝中起主要作用的酶，其在許多癌癥中均缺乏［23］；PTEN是一種抑癌基因，通過負調節AKT/PKB信號傳導途徑起抑癌作用［24］，而miR-21可通過此途徑誘導上皮-間充質轉化起關鍵作用［25］；RECK基因編碼的蛋白質是富含半胱氨酸的胞外蛋白質，其表達在許多腫瘤和各種癌基因轉化的細胞中均被強烈抑制，RECK的過表達可通過影響相關蛋白的表達來促進p53信號通路的激活，進而抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲［26］；RP2是X連鎖性視網膜色素變性的原因之一，多數X連鎖RP患者的色素性視網膜炎GTPase調節劑或RP2基因均發生突變［27］；SERPINB5是一種腫瘤抑制蛋白，在細胞質中的表達可用于預測p期IA肺腺癌患者的不良預后［28］；SESN1基因編碼雌激素家族的成員，編碼的蛋白通過激活AMP激活的蛋白激酶介導p53對細胞生長的抑制［29］；SLC16A10是質膜氨基酸轉運蛋白家族的成員，在頭頸癌中SLC16A10的表達量與預后存在明顯正相關，該基因可能是一種腫瘤抑制基因［30］；SOCS5是細胞因子誘導的細胞因子信號傳導的負調節因子，與過敏性支氣管哮喘有關［31］。

DAVID富集通路結果顯示，miR-21靶基因主要富集在“protein binding”通路上，蛋白質作為反式作用因子與DNA結合，可影響細胞增殖與細胞周期等生物學過程的發生，而腫瘤形成是細胞增殖與凋亡的調節和控制發生嚴重紊亂的結果［32-33］。

有研究發現，肺癌患者血清miR-21表達水平高于正常健康人群［34］；對于非小細胞肺癌的進展、轉移與預后具有診斷價值，其表達水平降低可作為肺癌治療效果的指標［35-36］，但尚未有miR-21表達水平針對肺癌病理分型檢測的報道。

為了評價血清miR-21對于肺癌的診斷和分型的價值，本研究采用RT-qPCR方法，檢測不同病理類型肺癌患者血清miR-21的表達水平，結果顯示，肺癌患者總體血清miR-21表達水平遠高于正常人群，差異有統計學意義（P＜0.001），與文獻報道相同；且腺癌患者血清miR-21表達水平顯著高于小細胞肺癌與鱗癌患者（P＜0.05），而小細胞肺癌與鱗癌兩者之間無顯著差異（P＞0.05），說明血清miR-21的表達與肺癌相關，且表達水平與肺癌的病理類型有關。

進一步利用ROC曲線評價血清miR-21的診斷效能，已知ROC曲線下面積（AUC）越大，其臨床診斷效能越大，當AUC＜0.5時，無診斷價值；AUC＞0.9時具有高診斷價值。本實驗結果顯示，血清miR-21診斷效能良好：肺癌AUC為0.915；小細胞肺癌為0.879；非小細胞肺癌為0.934，肺鱗癌為0.911，腺癌為0.963。結果揭示，血清miR-21對于各種類型肺癌均具有較好的診斷價值；針對病理分型，血清miR-21對于非小細胞肺癌的診斷優于小細胞肺癌，特別是對于腺癌具有最高的診斷價值，可能是作為AC早期診斷的高度敏感，穩定和可重復的生物標記。

與臨床傳統腫瘤標志物相比，目前，臨床上診斷小細胞肺癌推薦首選胃泌素釋放肽前體（ProGRP），ProGRP診斷小細胞肺癌AUC為0.921，臨界值為65.66 ng/L，靈敏度和特異性分別為90.90%和89.90%，對于小細胞肺癌的診斷，該指標優于血清miR-21，但是ProGRP不適合非小細胞肺癌的診斷［37］。肺鱗癌診斷推薦首選細胞角質蛋白19片段（CYFRA21-1）和鱗癌抗原（SCC-Ag）；腺癌則以癌胚抗原（CEA）和糖類抗原125（CA-125）為首選。魏晟瀟等［38］研究揭示，CEA和CA-125診斷非小細胞肺癌的AUC分別為0.839和0.843，其靈敏度分別為44.70%和59.30%，特異性分別為95.30%和90.40%。而血清miR-21診斷非小細胞肺癌的AUC為0.934、靈敏度為92.31%、特異性為80.00%，對比可知，對于非小細胞肺癌的診斷，血清miR-21優于CEA和CA-125。李沫等［39］研究揭示，CYFRA21-1、SCC-Ag和CEA對于肺癌診斷的AUC分別為0.710、0.403和0.667；靈敏度分別為70.50%、23.00%和52.50%；特異性分別為66.00%、69.80%和71.70%；CYFRA21-1和SCC-Ag診斷肺鱗癌的靈敏度分別為83.30%和46.70%；CEA診斷腺癌的靈敏度為63.00%；CYFRA21-1診斷肺鱗癌的靈敏度高于其他類型肺癌，CEA診斷腺癌的靈敏度高于其他類型肺癌，而血清miR-21診斷肺鱗癌的AUC、靈敏度和特異性分別為0.911、69.23%和100.00%，優于CYFRA21-1，血清miR-21診斷腺癌的AUC、靈敏度和特異性分別為0.963、92.31%和88.89%，優于CEA。

綜上，miRNA-21靶基因主要分布在細胞外，參與細胞凋亡、細胞增殖的調控過程、具有與ATP和蛋白質結合的功能，miRNA-21靶基因的異常表達可能與癌癥的發生密切相關。肺癌患者血清miR-21表達水平顯著高于正常人群；不同病理類型肺癌相比，肺腺癌患者血清miR-21表達水平顯著高于小細胞肺癌與肺鱗癌患者。血清miR-21表達水平的測定能夠輔助肺癌診斷，且有望用于腺癌的鑒別和病理分型，但尚無法區分小細胞肺癌與肺鱗癌。血清miR-21作為診斷肺癌的潛在腫瘤標志物，具有廣泛應用前景，一旦其檢測方法和參考區間得以明確，并與傳統肺癌腫瘤標志物進行聯合檢測，將顯著提高肺癌診斷效率，改善患者治愈率與生存期，臨床價值不容小覷。