脈沖電場作用下Hela細胞穿孔率研究

姜 松,朱 策

（上海理工大學 機械工程學院，上海 200093）

電穿孔現象最早發現于上世紀70年代，最初應用在輔助細菌細胞和哺乳動物細胞的體外基因轉移方面[1]。電脈沖消融法是基于電穿孔現象提出的，所謂電穿孔：是指細胞在外加電場的作用下，細胞膜磷脂雙分子層上形成瞬時微孔的生物物理過程。當細胞膜發生電穿孔時，膜的通透性會瞬時增大，使親水分子、DNA、蛋白質、病毒顆粒、藥物和染料顆粒等正常情況下不能通過細胞膜的分子得以進入細胞[2]。在外加脈沖電場取消后，如果微孔能夠閉合，則稱為可逆性電穿孔；如果微孔不能自我閉合，則稱為不可逆性電穿孔[3]。近年來，脈沖電場以其獨特的生物電效應成為研究熱點，并廣泛應用于基因轉染、藥物導入、腫瘤治療、創傷修復等領域[4-5]。電穿孔療法由日本Okino等[6]首次提出，隨后，國內外許多學者陸續開展了這方面的研究工作，并逐漸運用到臨床實踐。美國Hofmann教授等將其用于頭頸癌、皮膚癌、胰腺癌、肝癌的臨床治療中，并獲得了成功[7-8]。重慶大學姚陳果等[9]利用流式細胞儀對脈沖電場處理后的細胞周期進行了檢測，證明了脈沖電場抑制腫瘤細胞DNA的合成。在對動物的臨床實驗中，電穿孔療法也取得了不錯的效果，結果表明腫瘤區域明顯減少[10]。該課題組隨后還研究了脈沖電場的生物非熱效應及作用機理，將絕緣電介質的電擊穿和生物電介質的電穿孔聯系起來，通過調整電脈沖參數，提出了不用化學藥物，僅用高強度的脈沖電場，使腫瘤細胞發生不可逆電穿孔（即細胞死亡），從而實現非熱效應治療腫瘤[11-12]。

本文以宮頸癌Hela細胞作為研究對象，經脈沖電場處理后，利用臺盼藍染色原理分析細胞膜的穿孔程度。在固定脈沖寬度和個數的情況下，研究Hela細胞發生可逆和不可逆穿孔的場強閾值范圍，重點研究脈沖個數、脈沖寬度和電場強度對Hela細胞不可逆電穿孔的影響，并選擇優化的參數組合。

1 實驗材料、設備和方法

1.1 實驗材料

以宮頸癌Hela細胞為實驗對象，將其在恒溫培養箱中傳代大量培養后供實驗使用。為保證細胞的活性，用于實驗的均為對數生長期的細胞。

實驗中用到的其他材料包括：臺盼藍染色劑、酒精、培養皿、磷酸緩沖鹽(phosphate buffer saline，PBS)溶液、小牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶、移液槍、試管等。

1.2 實驗設備

實驗所用的處理電源為自制的脈沖電源。該電源可輸出方波脈沖，脈寬在5～100μs內精確可調，頻率在1～1000Hz內精確可調。其實物如圖1所示。脈沖作用下負載兩端的輸出電壓波形如圖2所示。

實驗采用的反應器為電極杯，電極間的距離為0.2cm，容量為400μl。其橫截面如圖3所示。

圖3 反應器橫截面Fig.3 Reactor cross section

實驗中用到的其他設備還有示波器、液氮罐、水浴鍋、離心機、細胞計數板、熒光顯微鏡等。

1.3 實驗方法

樣品配置：先將Hela細胞放在綜合培養基（10%小牛血清、90%DMEM）中，然后將其置于恒溫培養箱（37℃，5%CO2）中傳代到對數生長期。將培養好的細胞用胰蛋白酶消化后離心，再用PBS溶液洗滌2次，重懸，制成濃度約為106cfu/ml的細胞懸液。

電場處理：用質量分數為75%的酒精清洗電極杯，取上述細胞懸液與臺盼藍試劑均勻混合，用移液槍吸取懸液分別裝入電極杯中，每組400 μl。設置電脈沖參數，脈沖電場處理過后，取10 μl細胞懸液滴入計數板并計算穿孔率（包含可逆與不可逆）。同等條件下取上述細胞懸液先經電場處理后，再與臺盼藍試劑均勻混合，計算其不可逆電穿孔率。

細胞計數：臺盼藍是檢測細胞膜完整性最常用的生物染色劑，正常細胞會排斥這種染料，而對于膜的完整性喪失的細胞，通透性會增加，所以臺盼藍會進入細胞內將其染色。

圖4和圖5分別為用胰蛋白酶消化后，顯微鏡下的Hela細胞和被臺盼藍試劑染色的細胞。

圖4 消化后的Hela細胞Fig.4 Digested Hela cells

圖5 被染色后的Hela細胞Fig.5 Stained Hela cells

2 電脈沖作用對細胞穿孔的影響

2.1 可逆與不可逆穿孔的場強范圍

設置電脈沖參數：脈寬為50μs；脈沖為20個；電場強度依次取250 ，500，750 ，1000，1 250，1 500，1 750V/cm。第一組實驗：細胞懸液與臺盼藍試劑均勻混合后施加脈沖電場作用，測量穿孔率；第二組實驗：細胞懸液先經脈沖電場處理后，再與臺盼藍試劑均勻混合，測量不可逆電穿孔率。未施加電場強度的細胞懸液為對照組。細胞被染色，則說明該細胞發生了穿孔。以樣品中被染色的量作為統計指標，研究不同電場強度對細胞穿孔的影響，其結果如圖6所示。

圖6 脈沖強度對細胞穿孔的影響Fig.6 Effect of pulse intensity on cell perforation

由圖6可知，在脈沖寬度和脈沖個數不變的情況下，隨著脈沖電場強度的增加，Hela細胞被染色的數量越來越多，最終會趨于飽和。由第一組實驗可知，當場強在500 V/cm時，細胞幾乎未被染色；當場強達到750 V/cm時，有少量細胞呈現藍色。依據臺盼藍染色原理可知，被染色的細胞的細胞膜破裂發生了穿孔，此時，并不能確定細胞膜穿孔是可逆的還是不可逆的。在第二組實驗中，當場強為750V/cm時，并沒有發現被染色的細胞，說明在該場強作用下的第一組實驗中，被染色的細胞發生了可逆性穿孔，細胞膜上形成的微孔短時間內又自我修復了；當場強為1000 V/cm時，少量細胞被染色。由此可以推出：在脈寬為50μs和20個脈沖作用下，Hela細胞發生可逆性電穿孔的場強閾值范圍為500～750V/cm；同理，Hela細胞發生不可逆性電穿孔的場強閾值范圍為750～1000 V/cm。

細胞膜基本上是一個絕緣體，兩面浸在含離子的電解質溶液中，外加電場會引起兩邊的離子去極化，從而形成外加的膜電位差，此電位差就稱為跨膜電壓。在外加電場的誘導下，當外加電場頻率很低或為直流電場時，跨膜電位的表達式可簡化為[13]

式中：R為細胞半徑；E為外加電場強度；為細胞膜上任意一點的徑向與電場方向之間的夾角。細胞模型如圖7所示。由細胞跨膜電位的計算公式可知，相同強度的外加電場對大細胞的跨膜電位更高。即使是同種類細胞，其大小也有偏差。因此，電穿孔首先出現在那些大細胞上。跨膜電位的大小也隨著外加電場強度的增大而增大，細胞膜上的微孔將首先出現在0°和180°的兩個極點處。隨著電場強度的進一步增大，電穿孔出現的位置一般按cosθ的值由大到小順序進行擴展。在90°和270°時，cosθ為0，跨膜電位始終為0，不會發生電穿孔。

圖7 簡化的細胞模型Fig.7 Simplified cell model

圖8是細胞的等效電路圖。根據細胞膜、細胞質的電特性，細胞膜可等效為電容C1和電阻R1的并聯；細胞核膜可等效為電容C2和電阻R2的并聯；細胞質可等效為電阻R3；細胞外液可等效為電阻R4；Um表示外加的跨膜電壓大小。當給細胞懸液加電壓時，容性細胞膜充電，當超過細胞膜穿孔的閾值后，細胞膜發生穿孔，此時細胞內外離子流動大大削弱了細胞膜的屏蔽作用。如果將細胞中更小的細胞器如線粒體考慮進來，也可以把這些細胞器等效為細胞核。

圖8 細胞等效電路圖Fig. 8 Cell equivalent circuit diagram

2.2 脈沖個數對細胞不可逆穿孔的影響

根據以上實驗得到的Hela細胞發生不可逆電穿孔的場強閾值范圍，本次實驗固定場強1000V/cm和脈寬50μs不變，在不同脈沖個數的作用下研究細胞不可逆穿孔率，其結果如圖9所示。

圖9 脈沖個數對不可逆穿孔率的影響Fig.9 Effect of the number of pulses on irreversible perforation rate

由圖9可知，固定場強1000V/cm和脈寬50μs不變的情況下，隨著脈沖個數的增加，被染色的細胞數量也越來越多，電脈沖對細胞的不可逆穿孔率也隨之增加。當70個脈沖時，不可逆穿孔率達到90.07%；當80個脈沖時，不可逆穿孔率達到92.10%；隨著脈沖個數的繼續增加，Hela細胞的不可逆穿孔率會趨于飽和。所以，對于優化參數的選擇，本次實驗中脈沖個數選擇70個。

由脈沖個數對細胞的不可逆電穿孔實驗說明，脈沖電場對細胞膜的穿孔作用具有累積效應。單對細胞膜而言，膜電位主要由電荷的總量所控制，細胞膜可以看作是一個等效電容，在電脈沖的作用下，脈沖寬度T1、脈沖間隔時間T2、細胞膜的充電時間T3和細胞膜的彈性恢復時間T4，這4個時間量是非常重要的參數。對于脈沖個數的增加，相當于增加了作用時間，累積效應主要發生在T1+T2

2.3 脈沖脈寬對細胞不可逆穿孔的影響

根據以上實驗選取的70個脈沖，再固定脈沖電場強度為1000V/cm，在不同的脈沖寬度作用下研究細胞的不可逆穿孔率，其結果如圖10所示。

圖10 脈沖寬度對不可逆穿孔率的影響Fig.10 Effect of pulse width on irreversible perforation rate

由圖10可知，固定場強1000V/cm和70個脈沖的情況下，隨著脈沖寬度的增加，細胞的不可逆穿孔率先緩慢增加，在20μs時有明顯增大趨勢，50μs之后逐漸趨于飽和。所以，對于優化參數的選擇，本次實驗中脈沖寬度選取60μs，該條件下不可逆穿孔率為93.24%。

脈沖電場與細胞的相互作用是基于細胞膜充電，細胞膜可等效為一個電容。當外電場對細胞膜充電后，膜兩側存在相反的電荷，膜內電場力增加，細胞膜變薄，膜厚度的衰減程度取決于細胞膜的彈性模量。就脈寬為微秒級的單個脈沖而言，通常認為細胞膜電穿孔所需脈沖寬度的下限必須大于膜充電時間和膜的彈性恢復時間，這樣才能在單個電脈沖的作用下維持孔洞的開放。一般來說，在kV/cm級的脈沖作用下，細胞膜穿孔所需時間至少達到5μs[14]。脈沖寬度的增加會擴大單個細胞穿孔的程度，如果脈沖寬度小于膜充電時間，則必須提供較大的電場強度以驅使膜電位達到穿孔的臨界值。

2.4 脈沖場強對細胞不可逆穿孔的影響

根據上述實驗，固定脈寬60μs和70個脈沖不變，在不同的電場強度作用下研究細胞的不可逆穿孔率，其結果如圖11所示。

由圖11可知，在固定脈寬60μs和70個脈沖不變的情況下，隨著電場強度的增加，細胞膜的不可逆穿孔率也隨之增加。當外加場強達1 500 V/cm，不可逆穿孔率為93.42%，隨后趨于飽和。

圖11 電場強度對不可逆穿孔率的影響Fig. 11 Effect of electric field intensity on Irreversible perforation rate

細胞膜破裂的根本原因均是由于外加脈沖電場誘導下細胞膜跨膜電壓所形成的跨膜電場所導致的。細胞膜的厚度約為5～10nm，在無外加電場時，細胞為了維持自身的正常生理功能，細胞膜內外存在著50～70 mV的電位差[15]。在跨膜電位的作用下，細胞的結構和形態產生了不可逆的變化，即使電脈沖的作用時間極短，但對生物體的破壞也是相當大的。

2.5 結果與討論

由上述實驗結果可知，不同的脈沖參數會引發細胞膜不可逆穿孔程度的不同，其中脈沖個數、脈沖寬度和脈沖場強對細胞不可逆穿孔率的影響有相似之處。Hela細胞不可逆穿孔率都是隨著脈沖個數、脈沖寬度和脈沖場強的增加而增加的。在脈沖電場作用下，細胞主要經歷無影響（電脈沖劑量低）、可逆性電穿孔（存活）和不可逆性電穿孔（死亡）3個階段。

對于脈沖個數的增加，主要是作用于擴大電脈沖作用的累積效應；對于脈沖寬度的增加，主要是作用在細胞膜上形成微孔后，能夠維持孔洞的開放；對于脈沖場強的增加，就是增大細胞膜的跨膜電壓，會擴大穿孔區域的面積。通過本次實驗，對于這3種電脈沖參數的優化組合，宜選擇場強1 500V/cm、脈寬60μs和70個脈沖。

3 結 論

以宮頸癌Hela細胞為研究對象，通過外加脈沖電場處理和臺盼藍染色，進行穿孔率的檢測。在脈寬50μs和20個脈沖的情況下，Hela細胞發生可逆穿孔的場強范圍為500～750 V/cm，發生不可逆穿孔的場強范圍為750～1000 V/cm。在電脈沖的作用下，隨著脈沖場強、脈寬和個數的增加，Hela細胞的不可逆穿孔率也隨之增加。最終，選取電脈沖參數1 500V/cm、60μs和70個脈沖為優化的參數組合，該參數下Hela細胞不可逆穿孔率達到93.42%。

電穿孔主要的生物學效應是使細胞膜發生可逆和不可逆擊穿，仍需大量實驗研究將電穿孔的應用推向臨床，不斷完善電化學療法的臨床應用。