葛根素對噪聲慢性應激大鼠行為學及腦內記憶相關蛋白表達的影響

葛劍，王勇，陳謙學，王龍

(1.武警湖北總隊醫院神經外科，武漢 430061；2.武漢大學人民醫院神經外科，武漢 430060)

隨著機械化的進程、生活環境的變化，人們越來越多地暴露于各種應激源的刺激中[1]。噪聲被認為是當今社會三大公害之一，噪聲應激對人和動物的神經行為都會產生不良影響[2-3]。在應激源的刺激下，下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸會對應激進行適應性調節[4]，但人長期處于應激狀態下或應激過于強烈則會造成學習和記憶障礙、抑郁，甚至出現神經、免疫功能紊亂[5-6]。葛根素是從豆科植物野葛的干燥根中提取并分離出來的一種單體，主要成分為4，7-二羥基8-β-D葡萄糖異黃酮，屬異黃酮化合物。研究表明，葛根素對腦神經細胞有保護作用，可減少鈣離子內流及阻斷β受體，具有非內皮依賴性舒血管作用[7-8]，但其對噪聲刺激下慢性應激性大鼠行為學及腦內記憶相關蛋白的影響筆者尚未見報道。本實驗模擬生活中人們上下班高峰期暴露于噪聲環境，于固定時間段采用交通類型噪聲刺激建立慢性應激模型，探討葛根素在噪聲慢性應激大鼠行為學變化中的作用，為后續研究其潛在的藥理機制提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物無特定病原體(SPF)級生長發育期SD大鼠，體質量174～273 g，平均200 g，購自湖北省疾病預防控制中心實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(鄂)2019-0004。受試鼠飼養于SPF級標準動物房內，12 h/12 h 晝夜循環照明，室溫(20±3)℃，相對濕度50%～60%。

1.2藥品與試劑一抗：β-actin[天德悅(北京)生物科技有限責任公司，批號：TDY051，5%脫脂牛奶1：10 000)，瞬時感受器電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid subfamily member 1，TRPV1)(Abcam，批號：ab203103，5%脫脂牛奶1：500)，二抗：HRP-山羊抗兔(ASPEN，批號：AS1107，5%脫脂牛奶1：10 000)。酶聯免疫試劑盒蛋白激酶C(protein kinase C，PKC，批號：120685-11-2，靈敏度10 pg·mL-1)、腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF，Abcam，批號：ab108319，靈敏度1.0 pg·mL-1)、磷酸化cAMP 反應元件結合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein，p-CREB，Santa Cruz，批號：SC-7978，靈敏度0.1 ng·mL-1)購自上海源葉生物科技有限公司，其他試劑為國產分析純。

1.3儀器與設備ELx800酶標儀(美國Bio-Tek)，蛋白電泳及轉膜系統(美國Bio-Rad)，凝膠成像及分析系統(英國Syngene)，顯微鏡BX53(日本Olympus)，Morris 水迷宮軟件(美國San Diego Instruments，Inc Smart 2.0)，Morris水迷宮為國產通用大鼠型，圓柱形制桶，直徑150 cm，高50 cm，水深40 cm，平臺為直徑11 cm×高38 cm的圓形平臺。

1.4動物分組及給藥SD雄性大鼠 32只，按體質量隨機分為正常對照組、模型對照組和葛根素小、大劑量組，每組8只。參照文獻[9]，通過噪聲連續刺激60 d建立慢性應激大鼠模型：葛根素大、小劑量組及模型對照組置于90 dB噪聲場中，噪聲類型為白、粉噪類交通噪音，每天6 h(上午7：00—9：00，中午11：00—13：00，下午17：00—19：00)規律性刺激，予以2個月噪聲刺激，刺激同時給予正常喂養。正常對照組未做任何處理。造模結束后，對各組大鼠腹腔注射給藥，葛根素小劑量組予以葛根素100 mg·kg-1，大劑量組予以葛根素200 mg·kg-1，均用0.9%氯化鈉溶液配制成2 mL腹腔注射給藥，正常對照組與模型對照組用等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射給藥，每日1次，連續給藥1周。

1.5測量指標及方法

1.5.1體質量變化實驗過程中測定每只大鼠造模前及造模后第15，30，45天和給藥后(水迷宮實驗前)的體質量變化情況。

1.5.2蔗糖水消耗實驗參考相關實驗[10]：在隔噪音、安靜的房間內，訓練動物適應含糖飲水，每籠同時放置2個水瓶，第1個24 h，2瓶均裝有1%蔗糖水，隨后24 h，1個瓶裝1%蔗糖水，1個瓶裝純水。23 h禁食禁水后進行動物的基礎蔗糖水/純水消耗實驗，同時給予每只大鼠事先定量并稱量好的2瓶水：1瓶1%蔗糖水，1瓶純水。1 h 后，取走2瓶并稱定質量。計算動物的蔗糖水消耗(%)=蔗糖水消耗/總液體消耗×100%。分別于造模前、造模后第60天、給藥后(水迷宮實驗前)進行實驗，計算蔗糖水消耗。

1.5.3水迷宮實驗Morris水迷宮實驗時水溫保持(26±1)℃，室內安靜。將大鼠頭朝池壁放入水中，放入位置隨機取東、西、南、北四個起始位置之一。記錄大鼠找到水下平臺的時間(s)。每只大鼠每天訓練4次，兩次訓練之間間隔15～20 min，連續訓練5 d。最后一次獲得性訓練結束后的第2天，將平臺撤除，開始60 s的探查訓練。將大鼠由原先平臺象限的對側放入水中。記錄大鼠在目標象限所花的時間和進入該象限的次數，以此作為空間記憶的檢測指標。探查訓練結束后的第2天，開始維持4 d的對位訓練。將平臺放在原先平臺所在象限的對側象限，方法與獲得性訓練相同。每天訓練4次。每次記錄找到平臺的時間和游泳距離以及游泳速度。最后一次對位訓練的第2天進行，方法與上述探查訓練類似。記錄大鼠60 s內在目標象限(平臺第2次所在區)所花時間和進入該區的次數。水迷宮上方安置攝像機，用于同步記錄大鼠游泳軌跡，訓練期間水迷宮外參照物保持不變。

1.5.4TRPV1、PKC、p-CREB、BDNF蛋白表達檢測 免疫印跡法(Western blotting)檢測實驗鼠腦海馬組織TRPV1蛋白的表達水平，酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測PKC、p-CREB、BDNF蛋白的表達水平。

2 結果

2.1葛根素對噪聲引起的慢性應激大鼠體質量變化的影響見圖1。各組大鼠在造模前體質量相近，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；造模期間4組大鼠的體質量逐漸增加，但與正常對照組比較，模型對照組和葛根素組大鼠體質量增加較緩慢；造模結束至葛根素給藥第7 天，葛根素大、小劑量組體質量均大于模型對照組(t=3.455，4.230，P<0.01)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.葛根素小劑量組；D.葛根素大劑量組。

2.2葛根素對噪聲引起的慢性應激大鼠1%蔗糖水攝入量的影響 見圖2。各組大鼠在造模前1%蔗糖水攝入量相近，差異無統計學意義(P>0.05)。給予噪聲刺激60 d后，與正常對照組比較，模型對照組大鼠的糖水攝入量逐漸下降(P<0.01)，表明模型對照組大鼠出現快感消失；經葛根素處理后，1%蔗糖水攝入量有一定提高。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.葛根素小劑量組；D.葛根素大劑量組。①與模型對照組比較，t=7.986，P<0.01；②與模型對照組比較，t=4.586，P<0.05。

2.3葛根素對噪聲引起的慢性應激大鼠行為學指標的影響見圖3。正常對照組大鼠游泳路徑較為明確，主要集中在原平臺所在象限，而模型對照組大鼠游泳路徑大多出現在非平臺象限。從圖4可見，撤掉隱藏平臺后(水迷宮實驗第7 天)，與正常對照組比較，模型對照組大鼠在平臺所在象限所停留的時間明顯少于非平臺象限(P<0.05，P<0.01)；經小劑量葛根素處理后，所在象限停留的時間明顯上升(P<0.05)。模型對照組與正常對照組比較，在目標象限游泳總路程明顯下降(P<0.05)。經小劑量葛根素處理后，大鼠在目標象限游泳總路程有所上升(P<0.05)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.葛根素小劑量組；D.葛根素大劑量組。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.葛根素小劑量組；D.葛根素大劑量組。①與模型對照組比較，t=3.269，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.965，2.926，2.855，P<0.05。

2.4葛根素對噪聲引起的慢性應激大鼠腦內記憶相關蛋白TRPV1、PKC、p-CREB、BDNF表達的影響 見圖5。與正常對照組比較，模型對照組大鼠的腦海馬組織TRPV1蛋白表達水平顯著上調(P<0.01)；與模型對照組比較，葛根素大、小劑量組TRPV1蛋白表達水平顯著下調(P<0.01，P<0.05)。4組大鼠的腦海馬組織PKC、p-CREB、BDNF表達水平的熱圖見圖6，上述3種蛋白中，模型對照組PKC、p-CREB表達水平出現顯著變化。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.葛根素小劑量組；D.葛根素大劑量組。①與模型對照組比較，t=24.050，27.740，P<0.01；②與模型對照組比較，t=7.623，P<0.05。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.葛根素小劑量組；D.葛根素大劑量組。紫色表示蛋白水平下調，紅色表示上調，顏色強度表示蛋白表達的水平或趨勢，數據表示為樣本的平均值。

3 討論

基于2012—2016年道路交通噪聲監測數據，全國道路交通噪聲污染呈不斷惡化趨勢[11]。《中國環境噪聲污染防治報告(2016)》顯示，2015年全國城市噪聲污染仍較為嚴峻[12]。研究表明，人們在各種應激源的刺激中，噪聲刺激的影響尤為突出，噪聲的危害除了傳統認識上的聽力損傷，還有其他眾多不良影響[13]。研究顯示，環境噪音超過100 dB可影響血壓[14]；人若長期處在噪聲應激狀態下或應激過于強烈則會造成空間學習和記憶能力障礙[15]。本研究發現，噪聲引起的慢性應激大鼠的學習記憶能力受到了較顯著影響，而小劑量(100 mg·kg-1)葛根素可部分改善噪聲引起的慢性應激大鼠的空間學習記憶能力，葛根素的這一作用可能與腦海馬組織的記憶相關蛋白TRPV1、PKC、p-CREB、BDNF的表達水平相關。

在本研究中，經噪音刺激60 d期間，模型對照組大鼠體質量隨噪聲刺激時間加長出現增長緩慢，其糖水消耗量也逐漸降低，表明大鼠對食物的愉快感隨之降低。模型對照組在水迷宮實驗中逃避潛伏期明顯延長，在原有平臺象限游泳總路程明顯下降，表明噪聲刺激下慢性應激大鼠模型制備成功，且該模型大鼠的行為能力明顯下降。給予葛根素腹腔注射后，大鼠體質量增加，糖水消耗上升，且其在水迷宮中逃避潛伏期明顯縮短，在原有平臺象限游泳總路程明顯增加，且小劑量組與模型對照組之間實驗數據差異有統計學意義，說明葛根素可以部分改善噪聲刺激下慢性應激大鼠的空間學習和記憶能力，且小劑量作用效果更顯著，這與余玉玲等[16]發現小劑量葛根素有效降低D-半乳糖模型大鼠嗅球內tau 蛋白磷酸化水平的結果相一致。

本研究結果表明，模型對照組大鼠腦海馬組織的TRPV1、PKC表達顯著上調，p-CREB、BDNF表達顯著下調，而且葛根素小劑量組TRPV1、PKC表達顯著下調，p-CREB、BDNF表達顯著上調，提示葛根素改善噪聲刺激下慢性應激大鼠的行為學能力，或與腦海馬組織的記憶相關蛋白TRPV1、PKC、p-CREB、BDNF的表達水平相關。TRPV1作為鈣離子(Ca2+)通道廣泛分布于神經系統，PKC是G蛋白耦聯受體的效應器，在Ca2+信號轉導級聯反應中發揮著重要作用[17]。BDNF和p-CREB是核內轉錄因子介導的兩種重要的神經保護蛋白，它們的表達水平可以反映神經元抵抗細胞損傷的能力[18]。上述多功能蛋白可調節生化反應，并且參與神經系統功能的調控。研究表明，葛根素可減少Ca2+內流及阻斷β受體作用于下丘腦-垂體-腎上腺軸[7-8]；此外，WU等[19]證實葛根素通過抑制TRPV1、降鈣素基因相關肽和P物質預防紫杉醇誘導的大鼠周圍神經病理性疼痛。以上結果提示，Ca2+信號通路可能參與了葛根素的神經保護作用，其分子機制還有待進一步研究。