某生物醫(yī)藥廢水中乙腈降解菌的篩選與特性研究

邴 斌，韓 楊

（青島市市政工程設(shè)計研究院有限責任公司，山東青島 266100）

隨著各種工業(yè)包括人造纖維、石油化工和金礦等工業(yè)的不斷發(fā)展，含有有機腈類化合物的廢水也越來越多，如果不加以采取措施進行處理直接排放，將會對人類的健康以及生存環(huán)境造成很大的影響[1]。降解腈類微生物產(chǎn)生的腈水解酶是一種非常重要的工業(yè)用酶，可以在溫和的條件下將氰基水解成無毒的羧基和氨，由于腈水解酶具有高的化學選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性而備受人們的關(guān)注[2-3]。腈水解酶最早是由Thiman 和Mahadevan在1964 年從大麥葉中分離出來的[4]。許多研究者利用特定的腈類物質(zhì)作為唯一碳源或者唯一氮源篩選到一系列可以產(chǎn)腈水解酶的微生物（包括細菌和真菌）以及植物。本研究針對目前工業(yè)生產(chǎn)帶來的環(huán)境污染問題，從生物降解角度出發(fā)，從污泥中分離篩選可以降解乙腈的降解菌株，并對其生物特性進行了研究，為該類廢水處理的工程設(shè)計提供依據(jù)。

1 實驗材料和方法

1.1 樣品的來源

選擇山東某制藥廠乙腈洗料車間下水道污泥中進行樣品的采集，取10個取樣點的污泥，這里含有大量洗料殘留的乙腈，利用富集培養(yǎng)的方法進行降解微生物的篩選。乙腈和乙酸分別購自百靈威公司，其他試劑都為分析純。

1.2 高活性腈水解酶菌種快速篩選策略

初篩：將所采集的污泥（1g）加入10mL 0.85%生理鹽水中，用振蕩器振蕩均勻，靜置25～30min。然后取2mL上清至250mL裝有50mL富集培養(yǎng)基（以乙腈作為唯一氮源）的搖瓶中進行第一次富集，30℃，150r/min培養(yǎng)3d，接著將第一次富集的培養(yǎng)液取3mL至第二批富集培養(yǎng)液中進行第二次富集，3d后進行第三次富集。經(jīng)過三輪富集培養(yǎng)后對培養(yǎng)液進行梯度稀釋涂布平板，30℃培養(yǎng)2～3d。挑取單菌落于含有200μL以乙腈為唯一氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中，30℃， 150r/min，培養(yǎng)2d后，加入pH指示劑溴甲酚紫進行顯色，將顯黃色的菌從平板上挑取進行第二次復篩。

復篩：將初篩顯示黃色的菌種轉(zhuǎn)接到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，150r/min下，培養(yǎng)36～48h后，將發(fā)酵液離心9 000r/min，10min，將離心的菌體用生理鹽水洗滌三次，均勻懸浮于蒸餾水中制成一定濃度的菌懸液。取10mL菌懸液加入0.1g乙腈，降解一定的時間后，取樣進行氣相液相檢測分析。

1.3 最適降解條件的優(yōu)化方法

在10mL反應體系條件下，選取1%乙腈作為底物，不同轉(zhuǎn)化溫度為：20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃，在30 ℃，150r/min條件下降解一定的時間。在最優(yōu)溫度附近，選擇四個梯度35、45、55、65 ℃進行菌株的降解率穩(wěn)定性研究。

用6mol/L HCl和NaOH將自來水調(diào)至pH范圍為6.0～10.0不同梯度的水溶液作為反應體系，在30℃，150r/min條件下降解一定的時間，取出樣品進行GC檢測。為了考察不同pH的水溶液對菌株降解效率的穩(wěn)定性，本實驗選擇了四個pH不同的梯度：5、5.5、6、6.5，將降解菌株放于不同pH的水溶液中，置于0℃，定期取出于含有1%乙腈水溶液中，30℃，150r/min降解一定的時間。

2 結(jié)果和討論

2.1 溫度對降解率的影響

由于微生物胞內(nèi)存在可以降解氰類物質(zhì)的酶類，然而酶在降解乙腈物質(zhì)的過程中起著至關(guān)重要的作用，然而溫度會影響酶的作用能力。如圖1所示，降解過程中，溫度為45℃時，降解率達到最高；溫度低于45℃時，降解效率隨著溫度的升高呈上升趨勢；溫度高于45℃時，降解效率開始下降，因此在用降解菌株處理含有乙腈的污水時，需要考慮溫度的因素，在此研究中，最適降解溫度為45℃。

在工業(yè)處理廢水中，考慮降解菌株的降解氰類化合物的持久性，溫度穩(wěn)定在最適溫度條件下是否穩(wěn)定，成為被常 研究的因素，因此，本研究在最適溫度45℃附近，選擇了35、45、55和65 ℃四個梯度進行了研究，最長處理時間達16h，從圖2A可以看出，降解菌在35℃較為穩(wěn)定；

圖1 溫度對降解率的影響

根據(jù)公式（1），得到圖2B的擬合斜率，可以計算得知：降解菌株在35、45、55和65 ℃條件下的Kd分別為：0.052 49、0.263 21、0.75633和1.524 27，接著根據(jù)公式（2），計算出4個溫度下所對應的半衰期（降解菌株的降解率下降至50%所需要的時間）分別為13.2、2.63、0.91和0.45h。

圖2 不同溫度下降解率的穩(wěn)定性（A）和擬合曲線（B）

2.2 污水 pH 對降解菌降解率的影響

在進行污水氰基化合物的降解過程中，污水不同的pH對降解菌株的降解率會產(chǎn)生一定的影響。本實驗將污水的pH調(diào)至6.0～10.0，對其降解率進行了考察，如圖3所示，在不同pH條件下，降解菌株的降解率是不同的，當pH為7.0時，降解率較高，可以達到100%；當pH低于7.0時，隨著pH的降低，降解率呈劇降趨勢；當pH高于7.0時，降解率仍然會處于下降趨勢，因此污水的pH需要調(diào)節(jié)在6.0～7.0。

圖3 不同 pH 的污水對降解率的影響

在考察了pH對降解率的影響前提下，進一步考察了降解菌在最適pH范圍內(nèi)的穩(wěn)定性，本實驗采取了四個不同的pH來考察了降解菌pH的穩(wěn)定性，這4個pH分別為5、5.5、6.5、7。如圖4所示，pH在6.5時的降解率也是最穩(wěn)定的，基本與最適pH條件結(jié)果是吻合的。從整體的變化趨勢來看，該降解菌在微酸條件下還是較穩(wěn)定的。

圖4 不同 pH 下降解率的穩(wěn)定性

2.3 降解菌對乙腈的耐受研究

氰基化合物在較高的濃度下對降解菌是有一定的毒害作用，因此為了研究降解菌株對乙腈的最大耐受能力，在10mL降解體系中，分別加入不同濃度的乙腈，一定量的濕菌體量，30℃，150r/min降解一定的時間后取樣，進行降解率的分析。如圖5所示，降解菌在小于4% 乙腈范圍內(nèi)，降解率隨著濃度的升高而升高，但當乙腈的濃度超過4%，降解菌的降解率則處于下降趨勢，從而了解到該降解菌可以耐受的乙腈濃度為4%。

圖5 降解菌株對污水中乙腈的耐受性

3 結(jié)論

從山東某制藥廠乙腈洗料車間的下水道的污泥中進行樣品的采集，經(jīng)過富集培養(yǎng)的方法，篩選分離到一株具有降解乙腈能力的菌株，對該菌株降解乙腈的條件包括溫度、pH和乙腈耐受程度做了研究，該降解菌最適降解溫度為45℃，且在35℃較為穩(wěn)定，該降解菌在微酸條件下還是較穩(wěn)定的，其耐受的乙腈濃度為4%，相關(guān)成果為該類廢水處理工程的設(shè)計提供了依據(jù)。