MAPK 4敲除對DSS誘導小鼠急性潰瘍性結腸炎模型的影響①

唐 琳 冒 靈 官 蘞 陳 靜 周 涯陳 超 郭萌萌 趙娟娟 張繼東 徐 林

（遵義醫科大學免疫學教研室暨貴州省基因檢測與治療特色重點實驗室，遵義563000）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的一種常見類型，是胃腸道的常見炎癥疾?。?］。UC的臨床癥狀為黏液膿血便、腹痛、體重減輕、精神萎靡、四肢無力等，其長期發展將會增加結直腸癌發病風險［2-5］。UC典型的發病年齡在20至39歲之間［6］。研究表明，UC的發病率每年都在提高［7］。目前，UC的病因和發病機制尚未完全闡明，因此進一步加強其發生機制的研究，對于認識UC的發生機理及臨床治療新靶點的開發均具有重要意義。

絲裂原活化蛋白激酶4（mitogen-activated protein kinase 4，MAPK4）是非典型MAPK家族成員的分子之一，參與機體多種生理、病理過程，如免疫應答、腫瘤生成等［8-10］。然而，MAPK4是否參與UC的發生發展仍未有研究報道。本文擬采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）誘導的小鼠UC模型，觀察MAPK4敲除后對小鼠UC病理損傷的影響，為后續探討MAPK4在UC發生中的作用以及臨床治療新策略開發提供前期實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 7～9周齡C57BL/6的SPF級雄性WT和MAPK4 KO小鼠購自The Jackson Laboratory（027666）；光學顯微鏡（Olympus）；HE染色相關試劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）；DSS（MW 36000-50000；MP Biologicals）；C1000 Thermal cycler熒光定量PCR儀、S1000 Thermal cycler PCR儀、10%SDSPAGE試劑盒、凝膠成像系統（Bio-Rad）；RNAisoTMPlus、Prime Script RT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqⅡ（×2）（TaKaRa）；4%多聚甲醛、氯仿、異丙醇（重慶川東化工公司）；PCR引物（生工生物工程有限公司），序列見表1；兔抗鼠Gr-1一抗（Abcam）；DAB試劑盒、阿利新藍染色試劑盒、抗體稀釋液、甘氨酸、Tris、SDS（Solarbio）；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（CUSABIO）；蛋白提取試劑盒（凱基生物技術股份有限公司）；3×loading buffer、DTT（Cell Signaling Technology公司）；封閉蛋白液（博士德生物工程有限公司）；PVDF膜、ECL超敏化學發光液（Merck Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠UC模型 以C57BL/6小鼠為對照組，MAPK4 KO小鼠為實驗組，各取7～9周齡雄性小鼠（n=5），1～5 d喂養含有2%DSS的飲用水，6～8 d換成正常飲用水，每24 h稱重1次，記錄體重變化，觀察結腸炎癥情況，劑量參考文獻［11］。

1.2.2 小鼠結腸長度的測量、結腸病理組織切片染色（HE）構建結腸炎模型后，在第8天斷頸處死兩組小鼠后取結腸組織，測量其長度并拍照用PBS緩沖溶液沖洗后放入4%多聚甲醛溶液中固定，常規制備石蠟切片，將切片按步驟進行HE染色，光學顯微鏡下觀察HE染色后的切片。

1.2.3 小鼠結腸組織免疫熒光染色（immunofluorescence，IF）構建結腸炎模型后，在第8天斷頸處死小鼠取結腸組織，用PBS緩沖溶液沖洗后放入4%多聚甲醛溶液中固定，常規制備石蠟切片，封閉后，滴加免疫熒光抗體，孵育過夜，DAPI復染細胞核后脫水并封片，使用熒光顯微鏡進行觀察并拍照。

1.2.4 實時定量PCR檢測結腸組織中炎癥因子的mRNA水平 構建結腸炎模型后，在第8天斷頸處死小鼠取結腸組織提取總RNA，逆轉錄為cDNA，Real-time PCR檢測相關細胞因子的表達情況。mRNA的相對水平以對應標本的GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCt計算。引物序列見表1。

1.2.5 阿利新藍染色檢測模型小鼠結腸組織中酸性黏蛋白 石蠟切片脫蠟后，流水沖洗，加Alcian酸化液浸泡、Alcian染色液浸泡，核固紅染色液復染，脫水后，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察記錄。

1.2.6 ELISA檢測小鼠結腸組織炎癥因子的蛋白水平 取剪碎后結腸組織0.2 g加入0.2 ml PBS勻漿，離心取上清。按照試劑說明書，每孔加標準品或待測樣品，溫育甩干，加生物素標記工作液，溫育后甩干，洗板，加HRP-標記親和素工作液，溫育1 h洗板后加底物溶液，避光溫育加終止液后于450 nm處測吸光度值，按照標準曲線獲得炎癥因子的濃度，然后分析每克腸組織中炎癥因子含量。

1.2.7 Western blot檢測小鼠結腸組織 構建結腸炎模型后，在第8天處死小鼠取結腸組織，用PBS緩沖溶液沖洗后加入配好的Lysis Buffer，冰上裂解30 min，離心取上清至新的EP管中，BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液后，97℃變性10 min。經10%SDS-PAGE電泳，轉膜、封閉，加入相應的一抗，4℃孵育過夜，洗滌，常溫孵育二抗，洗滌，將膜放入配置好的ECL發光液中，于凝膠成像系統曝光。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結果

2.1 UC模型下小鼠MAPK4表達變化 與正常小鼠相比，模型小鼠結腸組織中MAPK4表達水平明顯增加（圖1，P＜0.05）。

2.2 UC模型下小鼠體重變化 與WT小鼠相比，在造模前3天，MAPK4 KO小鼠體重變化差異不明顯，從第4天開始，MAPK4 KO小鼠體重下降明顯減輕（圖2，P＜0.05）。

2.3 UC模型下小鼠結腸長度變化 進一步分析結腸長度變化情況，如圖3所示，MAPK4 KO模型小鼠結腸明顯長于WTUC模型小鼠，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

2.4 UC模型小鼠結腸組織病理性變化 如圖4A，HE染色結果顯示，相對于WT UC模型小鼠，MAPK4 KO模型小鼠結腸黏膜下層水腫較輕，黏膜下炎癥細胞浸潤較少。阿利新藍染色結果顯示，相對于WT UC模型小鼠，MAPK4 KO模型小鼠結腸組織中酸性黏蛋白較多（圖4B），表明MAPK4 KO模型小鼠的黏液層較厚，疾病癥狀較輕。

圖1 UC模型小鼠結腸組織中MAPK 4的表達Fig.1 Change of MAPK4 expression in colon tissue from UC mice

圖2 MAPK4敲除UC模型小鼠體重變化Fig.2 Weight change of MAPK 4 KO UC model mice

2.5 UC模型下小鼠結腸組織中性粒細胞浸潤變化 研究發現，中性粒細胞參與了UC的病理過程，本研究也檢測結直腸組織中性粒細胞浸潤的情況，發現相對于WT UC模型小鼠，MAPK4 KO模型小鼠結腸中性粒細胞較少，見圖5。

圖3 MAPK 4敲除UC模型小鼠結腸長度變化Fig.3 Changes of colon length from MAPK 4 KO UC model mice

圖4 MAPK4敲除UC模型小鼠結腸組織病理性變化Fig.4 Pathological changes of colon tissue in MAPK 4 KO UC model mice

圖5 MAPK 4 KO模型小鼠腸組織中性粒細胞浸潤變化（×400）Fig.5 Infiltration of neutrophil in MAPK4 KO UC model mice（×400）

圖6 MAPK4敲除模型小鼠結腸組織炎癥因子表達變化Fig.6 Changes of inflammatory factors in MAPK 4 KO UC model mice

2.6 UC模型下小鼠結腸組織炎癥因子變化 與WTUC模型小鼠相比，MAPK4 KO模型小鼠的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平明顯降低（P＜0.05），見圖6A～C；ELISA實驗結果如圖6D～F所示，與WT UC模型小鼠相比，MAPK4 KO模型小鼠的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族，是一組能被多種細胞外物質刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，參與機體多種生理病理過程［12-15］。MAPK4是非典型MAPK家族成員的分子之一，定位于18號染色體上，又稱ERK4。MAPK4參與機體多種生理、病理過程［16-18］。FENG等［19］報道在多發性骨髓瘤中，MAPK4可調控骨髓瘤發展進程。此外，MAPK4過表達可通過非典型AKT/mTOR信號通路的激活促進腫瘤進展［20］。然而，MAPK4在胃腸道疾病的作用及發病機制尚未有研究報道。本研究首次利用DSS誘導的UC模型觀察發現，與WT正常小鼠相比，UC模型小鼠腸組織中MAPK4表達增高；與WT UC模型小鼠相比，MAPK4 KO模型小鼠體重下降明顯減輕，結腸較長；并且，MAPK4 KO模型小鼠結腸黏膜下層水腫較輕，黏膜下炎癥細胞浸潤較少；阿利新藍染色結果進一步顯示，MAPK4 KO模型小鼠結腸酸性黏蛋白分泌較多，表明MAPK4 KO模型小鼠的黏液層較厚，疾病癥狀較輕。類似的也有研究發現結腸酸性黏蛋白分泌較多，疾病癥狀較輕，這與我們的發現是一致的［21-22］。

大量研究顯示包括中性粒細胞在內的炎癥細胞和一些炎癥因子參與了UC的發生過程［23-29］。如在腸道炎癥中，IL-1β水平顯著提高，且IL-1β的水平與黏膜炎癥的嚴重程度呈正相關［30］。我們進一步發現MAPK4 KO模型小鼠的結腸組織中性粒細胞浸潤明顯減少；同時還發現MAPK4 KO模型小鼠結腸組織中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達降低。PARK等［31］報道MAPK4可通過對炎癥小體NLRP3表達相關的NF-κB p65的激活影響神經元細胞損傷和炎癥疾病的發生。此外，TOUMPANAKIS等［32］發現吸氣阻力呼吸（IRB）后肺中ERK1/2被激活，ERK1/2抑制劑的使用阻止了IRB中IL-1β的增加，改善了IRB 6 h后肺泡灌洗液細胞的增加，并使濕肺重量恢復到控制值，抑制了IRB引起的肺炎癥損傷。這些結果提示MAPK4敲除減輕模型小鼠結腸炎癥，可能與炎癥細胞浸潤和炎癥因子分泌改變有關。然而，MAPK4參與UC發生的具體分子或細胞學機制仍有待后續進一步研究闡明。

綜上所述，本研究首次發現MAKP4敲除后可顯著減輕小鼠UC模型的炎癥損傷，為后續深入研究MAPK4在腸道炎癥疾病發生發展中的作用以及臨床治療新策略開發提供了重要的前期實驗依據。