miR-503-5p靶向VEGFA基因通過PI3K/AKT信號通路調控人絨毛膜癌細胞增殖、遷移和侵襲

謝迎春 鄧 丹 張玉梅 王 琴（貴州中醫藥大學第一附屬醫院婦科檢查室，貴陽550001）

絨毛膜癌是女性常見的惡性腫瘤，多繼發于葡萄胎、流產以后，少數發生于妊娠后［1］。絨毛膜癌的治療主要采用手術切除和化療，但手術治療創傷大，而化療副作用多［2］。尋找絨毛膜癌的新型分子治療靶點一直是領域內的研究熱點。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子單鏈非編碼RNA，在腫瘤的發生發展中起重要調控作用［3］。研究顯示，miR-503-5p參與卵巢癌等腫瘤細胞的增殖和凋亡，是腫瘤治療的潛在靶點［4］。目前，miR-503-5p對人絨毛膜癌細胞的調控作用及機制還未知。生物信息學軟件預測顯示，血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）是miR-503-5p的靶基因。VEGFA是促血管生長因子家族成員，參與腫瘤血管生成，在乳腺癌、胃癌、結直腸癌等腫瘤的發生發展中起重要作用［5-7］。本研究以miR-503-5p/VEGFA軸為切入點，探討miR-503-5p對人絨毛膜癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機制，以期為人絨毛膜癌的靶向分子治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人絨毛膜滋養層細胞HTR8/Svneo、人絨膜癌細胞系JEG-3、BeWo和JAR（中國科學院上海細胞庫），胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司），RPMI1640培養基（美國Gibco公司），四甲基噻唑藍（methylthiazoletrazolium，MTT）和胰蛋白酶（美國Sigma公司），逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司），Trizol試劑和LipofectamineTM2000試劑盒（美國Invitrogen公司），PCR引物（上海生工生物工程有限公司），細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、磷酸化的磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase，p-PI3K）、磷酸化的蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-AKT）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）抗體（北京中杉金橋生物試劑公司），二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），miR-503-5p模擬物（mimics）、miR-503-5p抑制劑、VEGFA的小干擾RNA（廣州銳博生物科技有限公司），雙熒光素酶活性檢測試劑盒（美國Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 用含10%FBS的RPMI1640培養基培養人絨毛膜滋養層細胞HTR8/Svneo、人絨膜癌細胞系JEG-3、BeWo和JAR，置于37℃、CO2體積分數5%、濕度97%的培養箱中。每隔1 d更換1次新鮮的培養基。細胞融合至80%～90%時，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細胞，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養。

1.2.2 細胞轉染和分組 對數生長期的JEG-3細胞，以每孔1×105個細胞接種于6孔板中，待細胞融合至60%時，更換不含FBS的培養基。參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明，分別將miR-503-5p mimcs（miR-503-5p組）、模擬物陰性對照（miRNC組）、miR-503-5p抑制劑（anti-miR-503-5p組）、抑制劑對照（anti-miR-NC組）、VEGFA的小干擾RNA（si-VEGFA組）、小干擾RNA陰性對照（si-NC組）、miR-503-5p mimcs與VEGFA過表達載體（miR-503-5p+pcDNA-VEGFA組）、miR-503-5p mimcs與空載體（miR-503-5p+pcDNA組）轉染至JEG-3細胞。轉染12 h后，更換新鮮培養基。培養箱中繼續培養至48 h后，收集細胞，用于后續實驗。

1.2.3 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測細胞中miR-503-5p和VEGFA mRNA表達水平 各組轉染后的細胞以每孔5×105個細胞接種于6孔板中，培養箱中培養48 h后，胰酶消化，收集細胞。PBS清洗后，Trizol試劑提取細胞中總RNA。微量核酸儀檢測RNA的純度和濃度，RNA溶液在260 nm處的吸光度值（absorbance，A）與280 nm處的A的比值（A260nm/A280nm）處于1.8～2.0范圍說明純度較好。參照逆轉錄試劑盒，將RNA逆轉錄為cDNA。然后以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR擴增條件：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個循環。引物序列：miR-503-5p上游5'-GGTCCGCGTAAGTGCAGAAGA-3'，下 游5'-GAGGTTCCGCGCTAGATCCGTC-3'；VEGFA上 游5'-GGGTTTAGACAAATGCTAG-3'，下 游5'-AAGTAGCGCGCVCATAGTT-3'；U6上游5'-ATGATAGTCGCTAGTCTGATC-3'，下 游5'-TTGACCGTAGCTGTATTTTGA-3'；GAPDH上游5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下 游5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。miR-503-5p以U6為內參，VEGFA以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算miR-503-5p和VEGFA mRNA的相對表達水平。

1.2.4 Western blot檢測細胞中VEGFA、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白水平 各組轉染后的細胞，以每孔5×105個細胞接種于6孔板中，培養箱中培養48 h后，胰酶消化，收集細胞。PBS清洗后，加入RIPA蛋白裂解液，提取細胞中總蛋白，BCA法對蛋白進行定量。取適量蛋白，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每泳道30μg蛋白。電泳后，電轉移至聚偏乙烯二氟膜。然后將聚偏乙烯二氟膜置于5%脫脂牛奶中，封閉1 h。分別加入VEGFA（稀釋度1∶800）、CyclinD1（稀釋度1∶400）、MMP2（稀釋度1∶600）和MMP9（稀釋度1∶600）抗體，4℃孵育過夜。第2天，加入辣根過氧化酶標記的二抗（稀釋度1∶200），37℃孵育1 h。加入ELC顯影液，避光顯影，凝膠成像系統曝光拍照。

1.2.5 MTT檢測細胞增殖 各組轉染后的細胞，以每孔5×103個細胞接種于96孔板中。每組設置3個復孔。培養箱中分別培養24 h、48 h和72 h后，每孔加入20μl的MTT溶液（5 g/L），繼續孵育4 h。吸棄培養基，每孔加入150μl二甲基亞砜，輕輕振蕩混勻，于酶標儀490 nm處測定光密度值（OD）。實驗重復3次。

1.2.6 Transwell檢測細胞的遷移和侵襲能力 各組轉染后的細胞，用不含FBS的RPMI1640培養基調整濃度為5×104個/ml。細胞遷移實驗：水化后的Transwell上室加入100μl細胞懸液，下室加入500μl含FBS的RPMI1640培養基。培養48 h后，取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定30 min。PBS清洗后，0.4%結晶紫染色15 min。然后置于倒置顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，計數。細胞侵襲實驗：先將Matrigel基質膠用RPMI1640培養基稀釋（比例1∶8），鋪于Transwell上室。自然晾干后，再加入100μl細胞懸液，后續操作同細胞遷移實驗。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-503-5p與VEGFA靶向關系 starbase生物信息學軟件預測顯示，VEGFA的3'非翻譯區（3'untranslated region，3'UTR）含有與miR-503-5p互補的核苷酸序列。由上海捷瑞生物工程有限公司合成VEGFA的3'UTR，并插入pGL3-Promoter質粒載體中，將該重組質粒命名為VEGFA-WT。利用定點突變技術將含miR-503-5p結合位點的VEGFA的3'UTR位點突變后，插入pGL3-Promoter質粒載體中，將該重組質粒命名為VEGFA-MUT。分別將VEGFA-WT、VEGFA-MUT與miR-503-5p mimic、miR-NC共轉染至JEG-3細胞。轉染12 h后，更換新鮮培養基。繼續培養至48 h后，收集細胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明，檢測熒光素酶活性。各組的熒光素酶活性以熒光蟲活性/海腎熒光強度比值表示。

1.3 統計學分析 利用SPSS22.0軟件分析實驗數據。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人絨膜癌細胞系中miR-503-5p和VEGFA表達水平 與HTR8/Svneo細胞比較，人絨膜癌細胞系JEG-3、BeWo和JAR中miR-503-5p水平均降低（P＜0.05），VEGFA mRNA和蛋白水平均升高（P＜0.05）。見圖1。

2.2 過表達miR-503-5p對人絨膜癌細胞JEG-3增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-503-5p組miR-503-5p水平升高（P＜0.05），說明miR-503-5p mimics轉染成功，JEG-3細胞中miR-503-5p過表達。與miR-NC組比較，miR-503-5p組JEG-3細胞48 h和72 h OD值、遷移和侵襲細胞數及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平降低（P＜0.05）。見圖2。

2.3 敲減VEGFA對人絨膜癌細胞JEG-3增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-VEGFA組VEGFA蛋白水平降低（P＜0.05），說明VEGFA小干擾RNA轉染成功，JEG-3細胞中VEGFA表達敲低。與si-NC組比較，si-VEGFA組JEG-3細胞48 h和72 h OD值、遷移和侵襲細胞數及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平降低（P＜0.05）。見圖3。

2.4 miR-503-5p靶向調控VEGFA表達 starbase生物信息學軟件預測顯示，VEGFA的3'UTR存在與miR-503-5p核苷酸序列結合的連續位點。miR-503-5p組共轉染WT-VEGFA的細胞熒光素酶活性低于miR-NC（P＜0.05），而miR-503-5p組共轉染MUTVEGFA的細胞熒光素酶活性與miR-NC差異無統計學意義（P＞0.05）。miR-503-5p組VEGFA蛋白水平低于miR-NC組（P＜0.05），anti-miR-503-5p組VEGFA蛋白水平高于anti-miR-NC組（P＜0.05）。這說明miR-503-5p靶向負調控VEGFA表達。見圖4。

圖1 人絨膜癌細胞系中miR-503-5p和VEGFA表達水平Fig.1 Expression levels of miR-503-5p and VEGFA in human chorionic cancer cell lines

圖2 過表達miR-503-5p對人絨膜癌細胞JEG-3增殖、遷移和侵襲的影響Fig.2 Effect of over-expressing miR-503-5p on proliferation，migration and invasion of human chorionic cancer cell JEG-3

圖3 敲減VEGFA對人絨膜癌細胞JEG-3增殖、遷移和侵襲的影響Fig.3 Effect of knockdown VEGFA on proliferation，migration and invasion of human chorionic cancer cell JEG-3

2.5 過表達VEGFA逆轉miR-503-5p對JEG-3細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-503-5p+pcDNANC組比較，miR-503-5p+pcDNA-VEGFA組JEG-3細胞48 h和72 h OD值、遷移和侵襲細胞數及VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平升高（P＜0.05）。見圖5。

圖4 miR-503-5p靶向調控VEGFA表達Fig.4 miR-503-5p targets VEGFA expression

圖5 過表達VEGFA逆轉miR-503-5p對JEG-3增殖、遷移和侵襲的影響Fig.5 Over-expressing VEGFA reversed effect of miR-503-5p on JEG-3 cells proliferation，migration and invasion

圖6 Western blot檢測p-PI3K、p-AKT蛋白表達Fig.6 Western blot detected expression of p-PI3K and p-AKT protein

2.6 PI3K/AKT通路相關蛋白的表達 與miR-NC組比較，miR-503-5p組p-PI3K和p-AKT蛋白水平降低（P＜0.05）。與miR-503-5p+pcDNA-NC組比較，miR-503-5p+pcDNA-VEGFA組p-PI3K和p-AKT蛋白水平升高（P＜0.05）。見圖6。

3 討論

miR-503-5p是近年來新發現的一種miRNA，參與腫瘤的發生發展。李小輝等［8］研究顯示，過表達miR-503-5p通過干擾Rb/E2F信號通路的轉導抑制膀胱癌細胞的增殖。JIANG等［9］研究顯示，過表達miR-503-5p通過靶向抑制WEE1表達降低肝細胞癌HCCLM3細胞的遷移和細胞上皮間質轉化，是肝細胞癌預后的潛在生物標志物。但目前，miR-503-5p對絨毛膜癌細胞惡性生物學行為的影響還未知。本研究以人絨毛膜滋養層細胞HTR8/Svneo為對照，采用qRT-PCR法檢測了人絨膜癌細胞系JEG-3、BeWo和JAR中miR-503-5p水平，結果顯示，人絨膜癌細胞系中miR-503-5p水平明顯低于絨毛膜滋養層細胞，提示miR-503-5p可能作為抑癌基因參與絨膜癌的發生發展。進一步轉染miR-503-5p mimics構建過表達miR-503-5p的JEG-3細胞，結果顯示，過表達miR-503-5p可有效抑制JEG-3細胞的增殖、遷移和侵襲，提示miR-503-5p是人絨膜癌治療的潛在分子靶點。

miRNA通常在轉錄后水平調控基因的表達，進而影響細胞的生物學行為［10-11］。為了進一步探討miR-503-5p影響人絨膜癌JEG-3細胞增殖、遷移和侵襲的作用機制，本研究通過starbase生物信息學軟件預測顯示，VEGFA的3'UTR存在與miR-503-5p核苷酸序列互補結合的連續位點，并通過雙熒光素酶活性實驗證實了miR-503-5p可與VEGFA的3'UTR靶向結合。同時，上調JEG-3細胞中miR-503-5p表達降低了VEGFA表達，而下調miR-503-5p表達促進了VEGFA表達，這些結果說明miR-503-5p靶向負調控VEGFA表達。作為促血管生長因子家族成員之一，VEGFA可促進腫瘤血管生成，而腫瘤血管生成是腫瘤細胞生長、遷移和侵襲的基礎，因此，抑制VEGFA表達對于延緩腫瘤發展具有積極意義［12］。本研究顯示，敲低VEGFA表達可抑制人絨膜癌JEG-3細胞增殖、遷移和侵襲，過表達VEGFA則降低了過表達miR-503-5p對JEG-3細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示過表達miR-503-5p通過抑制VEGFA表達發揮抗絨膜癌作用。

PI3K/AKT信號通路是VEGFA下游信號通路之一，參與腫瘤細胞的生長、遷移等生命過程。XU等［13］研究顯示，VEGF可作用于PI3K/AKT信號通路，在體外和體內抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和耐藥性。PI3K同時具備磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，其受到外界信號刺激后被激活生成p-PI3K。AKT是PI3K下游靶分子之一。p-PI3K進一步激活AKT（p-AKT）。p-AKT活化PI3K/AKT信號通路下游分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）［14］。活化的mTOR可促進CyclinD1與細胞周期蛋白依賴性激酶結合，啟動細胞周期。CyclinD1表達升高可促進細胞由G1期向S期轉變，加速細胞周期進程，促進細胞增殖，誘發腫瘤［15］。PI3K/AKT信號通路的激活還能夠促進MMP的表達，進而促進細胞遷移和侵襲［16］。本研究顯示，過表達miR-503-5p可降低JEG-3細胞中p-PI3K、p-AKT及CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白水平，提示過表達miR-503-5p抑制了PI3K/AKT信號通路。此外VEGFA過表達可逆轉過表達miR-503-5p對PI3K/AKT信號通路的抑制作用，提示miR-503-5p通過靶向負調控VEGFA表達，進而抑制了PI3K/AKT信號通路，從而發揮抗絨膜癌作用。

綜上所述，人絨毛膜癌細胞中miR-503-5p呈低表達，VEGFA呈高表達。過表達miR-503-5p可抑制人絨毛膜癌細胞增殖、遷移和侵襲，其可能通過靶向負調控VEGFA與抑制PI3K/AKT信號通路的激活發揮作用。