胰島間充質干細胞通過外泌體內源性反轉錄病毒抗原誘導NOD鼠自身免疫反應①

龔業莉 歐陽禮辰 張 雯 賁亞琍 戴 飏（江漢大學免疫疾病研究所，武漢430056）

研究胰島自身抗原的細胞來源有助于理解Ⅰ型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）的發病機理。由于胰島炎癥常常始發于胰島周圍，且在胰島中可檢測到施萬細胞抗原特異性的自身反應性T細胞，因此有研究者認為胰島周圍的施萬細胞可能是早期自身免疫靶細胞［1-2］。其他研究者認為胰島內皮細胞可能通過促進淋巴細胞進入胰島的機制在T1D的發病早期發揮作用［3］。有趣的是，將胰島在體外培養能夠擴增出一群成纖維樣細胞，這群細胞并非來源于分泌胰島素的β細胞，但可表達間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的表型標志分子如CD105及Sca-1［4］。免疫組化提示CD105+細胞在正常胰島組織中分布于胰島周邊區域，但隨著淋巴細胞浸潤胰島，這群細胞逐漸進入胰島深部、富含β細胞的區域。由此判斷，胰島間質細胞有可能參與觸發或維持胰島局部炎癥反應及自身免疫反應的過程。課題組前期觀察到體外培養的胰島MSCs能夠分泌具有免疫刺激功能的外泌體，且這些外泌體可激活NOD鼠體內所積累的自身免疫反應性T細胞和B細胞。因此，外泌體可能是攜帶自身抗原的載體，能夠在NOD鼠體內觸發自身免疫應答［5］。

外泌體是由細胞分泌的具有生物學活性的直徑為30～100 nm的微小泡。其存在于多種體液，如血液、唾液、乳汁、尿液及支氣管肺泡灌洗液［6-7］。外泌體為雙層膜結構，且富含膽固醇、鞘磷脂及蛋白質，因此其形態穩定并可通過超高速離心或密度梯度離心法從體液中分離得到［8-9］。外泌體蛋白質組學是近年的研究熱點，研究者希望從體液中分離出外泌體，尋找與疾病發生相關的新的標志物［10-11］。外泌體生物合成的分子途徑目前尚不明確，可能與多泡體的形成具有共同途徑［12］。多泡體通過與細胞膜融合的方式將胞內形成的外泌體分泌到細胞外，故外泌體可能攜帶分泌它們的細胞的特殊分子。本研究試圖探討NOD小鼠胰島細胞分泌的外泌體是否攜帶誘導自身免疫反應和T1D的特殊抗原。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 NOD/ShiLtJ（NOD）及C57BL/6（B6）小鼠均購自美國Jackson實驗室（Bar Harbor，ME）。所有動物實驗的進行均得到江漢大學免疫疾病研究所及美國南加州生物醫學研究所動物管理及使用委員會批準。

1.1.2 儀器與試劑 超速離心機（Sorvall Discovery 90SE；Hitachi）；分光光度儀（Bio-Rad，Hercules，CA）；增強型化學發光（ECL）檢測系統（Amersham）；膠原酶（Sigma）；抗CD32/CD16抗體（克隆2.4G2，BD Bioscience）；抗CD45抗體（克隆30-F1，BD Bioscience）；抗CD105抗體（克隆MJ/18，BioLegend）；抗Sca-1抗體（克隆D7，BioLegend）；ABC試劑盒（Vector Laboratories，Burlingame，CA）；OCT復合物（Sakura Finetek，Torrance，CA）；CBA試劑盒（BD Biosciences）；CFSE染料（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）；HRP標記抗IgG二抗（Amersham，GE Healthcare Life Sciences）；鼠抗MLV Gag抗體（抗p15及抗p30山羊血清，ATCC）；抗ERK抗體（Cell Signaling Technology，Danvers，MA）；RNA提取試劑盒（Qiagen）；cDNA合成試劑盒（Thermal Fisher）；PCR Supermix（Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 胰島分離培養及胰島細胞的流式分選 分離NOD小鼠的胰島采用LEITER等［13］報道的方法。簡單敘述如下：將處死后的小鼠打開腹腔，在解剖顯微鏡下通過膽總管向小鼠胰腺灌注3 ml 0.46 mg/ml的膠原酶，隨后取出胰腺組織。將灌注的胰腺組織置于37℃水浴鍋消化25 min，劇烈振蕩以分離胰腺組織及細胞，在解剖鏡下挑取單個胰島細胞團。如需培養胰島MSCs，先以PBS清洗分離的胰島細胞團2次，再接種于高糖DMEM完全培養基，培養基成分為10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素及6 mmol/L L-谷氨酰胺。培養的第1周無需更換培養液，增殖的MSCs為貼壁的纖維狀細胞。如需制備胰島單細胞懸液以進行流式分析，將分離的胰島細胞團置于0.5 ml 0.05%的胰酶-EDTA，37℃水浴2 min，通過吸管反復吹打以分離單個細胞。PBS清洗2次后，加入抗CD32/CD16抗體以封閉Fc受體，再加入PE標記的抗CD45抗體及APC標記1∶100稀釋的抗CD105或Sca-1抗體置于冰上孵育45 min。加入PBS清洗后重懸于0.5 ml 1%BSA/PBS中進行流式分析或分選。

1.2.2 外泌體制備 所有用于細胞培養的小牛血清均需預先在100 000 g下離心90 min以去除外泌體。收集體外培養的胰島MSCs第2至第10代的細胞培養上清。將上清于300 g離心20 min，取上清再次于4℃、10 000 g離心20 min，離心后的上清經0.22μm濾膜過濾去除大直徑囊泡，于100 000 g離心90 min收集外泌體。PBS清洗1次后將外泌體重懸于PBS。Bradford實驗檢測蛋白濃度。1 L胰島MSCs培養上清中約可收集到0.5～1.0 mg外泌體。

1.2.3 免疫組化及電鏡檢測 將胰腺組織包埋于OCT復合物并于-80℃儲存。制成的冰凍切片（厚度8μm）先用親和素和生物素封閉，再加入生物素標記的一抗孵育過夜。清洗切片后，加入HRP標記鏈霉親和素共孵育。最后用標準ABC試劑盒對切片進行顯色。將切片用蘇木精復染，染色后細胞核為藍色，而與一抗結合的細胞為紅色。外泌體的形態通過透射電鏡檢查。首先將外泌體固定于2%戊二醛，清洗后用2%醋酸鈾對其染色，然后包埋于0.8%醋酸鈾與0.13%甲基纖維素混合物進行電鏡觀察。

1.2.4 細胞因子檢測和細胞增殖實驗 細胞釋放的IFN-γ采用一種基于顆粒的細胞因子檢測方法，此方法通過流式細胞儀檢測，敏感度高達5～10 pg/ml。根據標準品繪制標準曲線并計算出每組細胞培養上清中IFN-γ濃度。細胞增殖通過細胞染料CFSE檢測，簡述如下：在脾細胞重懸液（1×107個/ml PBS）中加入5μmol/L CFSE染料，37℃水浴孵育10 min，清洗后重懸于等體積的細胞培養基，再將其接種于96孔板（8×105個/孔），與外泌體共同培養72 h后收集細胞，用熒光標記B220抗體及CD4抗體染色，流式細胞術檢測CFSE染色陰性的增殖細胞。

1.2.5 Western blot 裂解細胞后，按照文獻中報道的SDS-PAGE方法分離細胞裂解液中蛋白［14］。溶于PBS的外泌體直接用于SDS-PAGE分析。在所有樣本中加入5×SDS上樣緩沖液，并于95℃加熱10 min使蛋白變性。將分離的蛋白轉到硝酸纖維素膜后，加入1μg/ml或1∶1 000稀釋一抗在室溫下孵育1 h，再加入HRP標記抗IgG二抗。通過增強型化學發光（ECL）檢測系統檢查蛋白條帶。

1.2.6 RT-PCR檢測胰島ERV表達 在分選或未分選的胰島組織中加入RTL裂解液。提取上述細胞或組織的總RNA并溶于無RNA酶水。采用cDNA合成試劑盒中的隨機引物合成單鏈cDNA。隨后以cDNA為模板采用PCR Supermix進行PCR擴增。引物序列為：ERV Gag F：5′-CCCGATCTGCCC TTTACCC-3′，R：5′-CTTTTACCTTGGCCAAATTGG-3′；IFN-αF：5′-GGACTTTGGATTCCCGCAGGAGAAG-3′，R：5′-GCTGCATCAGACAGCCTTGCAGGTC-3′；GAPDH F：5′-CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC-3′，R：5′-TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3′。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸90 s；共進行12個循環；然后94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s；共進行25個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結果

2.1 胰島MSCs的培養及鑒定 8～10周NOD雌性小鼠的胰島如圖1A，將其接種于高糖DMEM培養基中培養1～2周后觀察到成纖維樣的基質細胞如圖1B，流式細胞術檢測發現這些細胞表達MSCs的表面標志分子，如CD44、CD90、CD81、CD105和Sca-1（結果未顯示），因此將這群細胞稱為胰島MSCs。流式細胞術分析新鮮的NOD小鼠胰島單細胞懸液結果表明，在8周小鼠的胰島中CD105+細胞約占CD45－細胞的2%～5%（圖1C），且這些細胞中80%以上表達干細胞標志分子Sca-1，證實這群CD105+Sca-1+細胞為主要的胰島MSCs。免疫組化結果表明，CD105+細胞主要聚集于胰島組織外周，這些細胞伴隨淋巴細胞的浸潤而進入β細胞區域（圖1D）。且這些細胞似乎在引導淋巴細胞的浸潤并首先出現在無淋巴細胞浸潤的胰島深部區域。

2.2 NOD來源的外泌體較B6來源的外泌體具有更強的免疫刺激作用 電鏡下2種外泌體無明顯形態上的差異（圖2A），但在刺激NOD小鼠脾細胞增殖和分泌細胞因子上存在顯著差異。研究發現，當脾細胞與NOD外泌體共培養48 h后，約有4.3%的B220+細胞被激活并增殖，而與B6外泌體共培養后增殖的細胞小于1.9%（圖2B）。對培養的脾細胞中分泌IFN-γ的CD4+T細胞比例進行檢測，結果表明，相比B6來源外泌體（1.6%），NOD來源外泌體（10.2%）能更有效地激活IFN-γ分泌（圖2C）。以上結果提示NOD來源外泌體較B6來源外泌體具有更強的免疫刺激作用。

圖1 胰島MSCs的鑒定Fig.1 Identification of islet MSCs

圖2 NOD鼠來源的外泌體比B6鼠來源的外泌體具有更強的免疫刺激性Fig.2 Exosomes derived from NOD mice have stronger immune-stimulatory function than exosomes from B6 mice

圖3 NOD來源的外泌體表達ERV Gag蛋白Fig.3 NOD-derived exosomes express ERV Gag protein

2.3 NOD來源的外泌體表達ERV病毒的Gag抗原 由圖3A可知，NOD來源的MSCs及MIN6細胞均表達ERV Gag p15及p30抗原，但B6來源的MSCs不表達該抗原。同樣，NOD及MIN6來源外泌體表達p15抗原，而B6來源外泌體不表達（圖3B）。此結果明確顯示僅NOD來源的MSCs和外泌體表達這種內源性病毒抗原，提示表達ERV抗原可能參與外泌體誘導的免疫刺激效應。

圖4 表達ERV Gag基因的胰島細胞主要為干細胞及間質細胞Fig.4 Gag-expressing cells in islets are mainly stem cells and stromal cells

2.4 胰島CD105+間質細胞，而非CD45+造血細胞或淋巴細胞表達ERV Gag基因 如圖4A所示，NOD胰島單個細胞染色可分離出CD45陽性的血源性細胞或CD105單陽性的組織間質細胞。由圖4B可知，CD45+及CD105+細胞均表達IFN-α基因，而僅CD105+細胞而非CD45+細胞表達Gag基因。表明胰島中表達ERV Gag基因的細胞為間質細胞，而非浸潤胰島的淋巴細胞。

3 討論

T1D是T細胞介導的自身免疫性疾病，但其確切發病機制目前尚不明確，患者一旦確診需終身依賴胰島素治療，這種終身治療方式給患者及家庭帶來巨大的經濟和心理負擔。因此，找到T1D的確切發病機制，特別是觸發疾病的初始細胞和T細胞抗原，可能為其治療帶來曙光。課題組前期發現細胞釋放的外泌體在激活或調控免疫反應過程中發揮重要作用［14］。本研究發現胰島組織也存在一群MSCs，這群細胞能夠釋放外泌體。通過比較NOD小鼠及B6小鼠胰島MSCs分泌的外泌體的免疫原性發現NOD鼠MSCs分泌的外泌體比B6小鼠MSCs分泌的外泌體具有更強的免疫刺激作用，能夠激活NOD小鼠脾細胞分泌IFN-γ并刺激部分B220細胞增殖，提示NOD鼠胰島MSCs分泌的外泌體在觸發T1D自身免疫反應中可能發揮重要作用。

外泌體攜帶的蛋白抗原是其實現激活免疫反應的關鍵。課題組前期結果提示胰島瘤細胞系MIN6釋放的外泌體中存在大量ERV抗原［15］。本研究進一步發現NOD小鼠而非B6小鼠胰島來源的MSCs或外泌體同樣表達這類ERV Gag抗原，且表達ERV抗原的細胞僅局限于CD45－CD105+的間質細胞，與其他研究組的報道一致，既往報道NOD鼠而非T1D抵抗小鼠的胰島中存在反轉錄病毒樣顆粒［16-17］。NOD來源的外泌體刺激NOD脾細胞分泌IFN-γ，Gag抗原可能參與此過程，因為B6來源的外泌體不表達Gag抗原也不具備激活IFN-γ的能力，且B6的脾細胞并不對NOD來源的外泌體產生類似的反應。NOD小鼠富含分泌IFN-γ的T細胞，可以判斷Gag抗原可能通過激活這些T細胞誘導自身免疫反應，這一結論同樣在本課題組前期敲除外泌體中Gag抗原的實驗中得到支持［15］。除T細胞反應之外，課題組同時觀察到NOD來源的外泌體還能有效地激活B細胞，被激活的B細胞應該同樣為自身反應性細胞，因為B6來源的脾細胞不能被外泌體激活。課題組前期發現NOD小鼠脾臟邊緣區B細胞能夠在缺乏T細胞的情況下對外泌體產生應答，且8～12周NOD雌鼠中能夠對外泌體產生應答的B細胞數量顯著高于雄鼠，提示外泌體誘導的非T細胞依賴性B細胞應答在T1D的發病中發揮作用［18］。一般認為自身反應性B細胞主要通過其有效的抗原遞呈功能參與誘導自身反應性T細胞的產生［19］。值得注意的是，這群自身反應性B細胞在識別外泌體的過程中同時需要TLR和BCR信號途徑滿足非T細胞依賴的特性，提示NOD外泌體可能同時攜帶天然免疫和自身免疫性抗原。本研究進一步發現NOD小鼠MSCs分泌的外泌體能夠刺激部分B220+細胞增殖，其刺激能力顯著高于B6小鼠MSCs分泌的外泌體。推測NOD小鼠MSCs來源外泌體攜帶的抗原，如ERV膜抗原可能在T1D早期B細胞的激活中發揮重要作用。

目前對ERVs是如何參與誘導胰島特異性的自身免疫反應的問題尚未明確。人類ERV包膜蛋白Syncytin可通過外泌體方式被釋放到胎盤中，其在母胎免疫耐受中可能扮演重要作用［20］。有趣的是T1D患者的胰島也會表達ERV抗原，不過是人源的ERV［21］。由于細胞能夠表達缺陷性ERV中的部分完整基因，這類病毒抗原可能通過外泌體的方式被釋放到細胞外并參與免疫激活或調控。

綜上所述，本研究發現NOD小鼠胰島干細胞分泌的外泌體表達ERV Gag抗原，并具有較強的免疫原性，提示外泌體可能模擬類病毒誘導抗ERV抗原的免疫刺激應答，為進一步研究ERV Gag在NOD小鼠糖尿病發病中的作用奠定基礎。后續研究工作將集中在從NOD小鼠，特別是胰島MSCs中分離和鑒定Gag抗原來研究那些能識別該抗原及多肽的T細胞，并檢測其在誘發自身免疫反應和糖尿病過程中的關鍵作用。