miR-31對骨關節炎軟骨細胞增殖、凋亡及炎癥因子表達的影響

竇越超 張亞奎（首都醫科大學附屬北京潞河醫院，北京101100）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性關節疾病，表現為關節軟骨結構和功能完整性的破壞以及炎癥反應［1］。隨著全球人口老齡化的加劇，OA發病率逐年上升，已成為世界范圍內疼痛、殘疾、縮短成人工作壽命的主要原因。目前尚無有效的防治方法，關節置換術是終末期OA的主要治療方法。大量研究表明在OA進展過程中，過度的炎癥反應與細胞凋亡相關，導致軟骨細胞的減少和內穩態失衡［2］。因此，如何提高軟骨細胞活力，抑制細胞凋亡，減輕炎癥反應對OA防治意義重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類較保守的短鏈非編碼RNA，是細胞增殖、分化、炎癥反應和凋亡等多種功能的關鍵調控因子，目前miR-195-5p、miR-206等多種miRNA已被證實參與OA的發生發展［3-4］。最近研究顯示，OA患者關節軟骨組織miR-31表達下調，然而其在OA進展中的作用并未完全闡明［5］。IL-34是近年來發現的一種新型炎癥細胞因子，已有研究顯示OA患者滑膜液中IL-34高表達與疾病的嚴重程度呈正相關，阻斷IL-34功能可以減輕炎性關節炎的嚴重程度［6］。生物信息學分析顯示IL-34是miR-31的潛在功能性靶基因，但miR-31能否靶向IL-34參與OA進展尚未可知。本研究通過IL-1β誘導軟骨細胞構建OA細胞模型，探討miR-31靶向IL-34在OA軟骨細胞增殖、凋亡和炎癥反應中的確切作用，以期為OA的防治提供新的理論依據［7］。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠購自南京君科生物工程有限公司；DMEM-F12培養基購自美國Hyclone公司；IL-1β購自美國Peprotech公司；TaKaRa反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq購自大連寶生物工程有限公司；miRNA模擬物陰性對照（miR-NC）、miR-31模擬物（miR-31 mimics）、miRNA抑制物陰性對照（anti-miR-NC）、miR-31抑制物（anti-miR-31）、空載體（pcDNA3.1）、IL-34過表達載體（pcDNA3.1-IL-34）由上海吉瑪制藥有限公司提供；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；MTT試劑、二甲基亞砜、RIPA裂解液、Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒北京索萊寶生物科技有限公司；兔源P21、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、IL-34和磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購自美國Abcam公司；TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、模型構建和實驗分組［7］于超凈工作臺內取正常大鼠雙側膝關節軟骨，采用含青鏈霉素雙抗的PBS液清洗，離心后棄去上清，用含20%胎牛血清的DMEM-F12培養基于37℃、含5%CO2培養箱中進行培養。將正常軟骨細胞分為以下幾組：對照組，正常培養的軟骨細胞；模型組，用10 ng/L的IL-1β處理軟骨細胞24 h；模型+miR-NC組，轉染miR-NC 48 h后再用IL-1β誘導軟骨細胞；模型+miR-31組，轉染miR-31 mimics 48 h后再用IL-1β誘導軟骨細胞。

為證實miR-31是通過調控IL-34表達進而影響OA軟骨細胞的增殖、凋亡和炎癥因子表達，將miR-31 mimics分別與pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-34共轉染軟骨細胞，再用IL-1β誘導24 h，依次記為模型+miR-31+pcDNA3.1組、模型+miR-31+pcDNA3.1-IL-34組。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-31和IL-34 mRNA的表達 收集按照實驗分組進行處理的各組細胞，Trizol法提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。利用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA逆轉為cDNA，按照熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq說明書配置反應體系，利用2-ΔΔCt法分析miR-31和IL-34 mRNA的相對表達水平。miR-31正向引物5′-GCGGCGGAGGCAAGATGCTGGC-3′，反向引物5′-AGGCAAGATGCTGGCATAGCT-3′；IL-34正向引物5′-AATCCGTGTTGTCCCTCTTG-3′，反向引物5′-CAGCAGGAGCAGTACAGCAG-3′；GAPDH正向引物5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，反向引 物5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反 向 引 物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力 將對數期軟骨細胞接種到96孔板（5×103個/孔），按照實驗分組進行細胞轉染，然后采用10 ng/L的IL-1β處理軟骨細胞24 h，每孔加入20μl的MTT溶液，孵育4 h后棄去上清液，每孔加入200μl的二甲基亞砜，振蕩15 min至結晶完全溶解，以無細胞空白孔調零后，在490 nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。存活率=實驗組OD/對照組OD×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞按照實驗分組進行干預后，收集各組細胞，PBS洗滌細胞后，采用適量結合緩沖液調整細胞密度的1×106個/ml的單細胞懸液。取100μl置于流式管內，分別加入5μl的Annexin V-FITC和5μl的PI，避光孵育15 min，加入400μl結合液緩沖液，混勻，立即采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測P21、Caspase-3和IL-34蛋白的表達 采用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒進行定量。蛋白樣品經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉到聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h。洗膜后，加入一抗4℃孵育過夜，洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，洗膜后，加入化學發光試劑進行染色。利用Tanon 4200化學發光成像系統分析圖像，以目的蛋白灰度值和GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

1.2.6 ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α和IL-6的表達 各組細胞按照實驗分組進行干預后，收集各組細胞上清液，按照TNF-α和IL-6檢測試劑盒說明書進行操作，測定TNF-α和IL-6的表達水平。加樣后，37℃溫育30 min，洗滌5次后，加入50μl的酶標抗體，溫育、洗滌后，加顯色液顯色，檢測吸光度值并換算為TNF-α和IL-6的表達水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-31對IL-34的靶向調控作用 構建含有miR-31結合位點的野生型（WT-IL-34）和含有miR-31結合位點突變序列的突變型（MUT-IL-34）熒光素酶報告基因載體由上海吉瑪制藥有限公司提供。利用LipofectamineTM2000將miR-NC、miR-31 mimics分別與WT-IL-34或MUT-IL-34共轉染軟骨細胞，經IL-1β誘導24 h，采用熒光素酶報告基因試劑盒檢測各組細胞載體的熒光素酶活性。

1.3 統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行統計學分析，每組設置3個平行實驗并重復3次，所有實驗數據均采用±s表示。采用t檢驗進行兩組間均數比較，多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比價采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 炎癥因子IL-34在OA軟骨細胞的表達 見圖1，相較于對照組，模型組軟骨細胞中IL-34 mRNA的表達水平顯著增加（P＜0.05）。

2.2 過表達miR-31對OA軟骨細胞的細胞存活率凋亡的影響 見圖2，與對照組比較，模型組軟骨細胞P21和Caspase-3蛋白的表達顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高；與模型+miR-NC組比較，模型+miR-31組軟骨細胞P21和Caspase-3蛋白的表達顯著降低，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

2.3 過表達miR-31對OA軟骨細胞中炎癥因子表達的影響 見圖3，與對照組比較，模型組軟骨細胞中miR-31的表達顯著降低，炎癥因子TNF-α和IL-6表達顯著升高；與模型+miR-NC組比較，模型+miR-31組軟骨細胞中miR-31的表達顯著升高，炎癥因子TNF-α和IL-6表達顯著降低（P＜0.05）。

圖1 IL-34在OA軟骨細胞中的表達Fig.1 Expression of IL-34 in OA chondrocytes

圖2 過表達miR-31對OA軟骨細胞的細胞增殖（A）凋亡（B、C）及P21、Caspase-3蛋白表達（D、E）的影響Fig.2 Effect of overexpressing miR-31 on cell proliferation（A）apoptosis（B，C）and P21，Caspase-3 protein expression（D，E）of OA chondrocytes

2.4 miR-31靶向、調控IL-34 采用targetscan進行靶基因預測顯示，miR-31與IL-34的3'-UTR區域存在部分特異性結合的位點，見圖4A。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，與miR-NC和WT-IL-34共轉染組比較，miR-31和WT-IL-34共轉染組軟骨細胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；與miR-NC和MUT-IL-34共轉染組比較，miR-31和MUT-IL-34共轉染組軟骨細胞的熒光素酶活性無顯著變化，見圖4B。Western blot檢測顯示，與miR-NC組比較，miR-31組軟骨細胞中IL-34在mRNA和蛋白水平的表達均顯著降低；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-31組軟骨細胞中IL-34在mRNA和蛋白水平的表達均顯著升高（P＜0.05），見圖4C、D。說明miR-31靶向IL-34并負調控其表達。

2.5 過表達IL-34能逆轉miR-31對OA軟骨細胞的細胞存活和凋亡的影響 見圖5，與模型組+miR-31+pcDNA3.1組比較，模型組+miR-31+pcDNA3.1-IL-34組軟骨細胞IL-34、P21和Caspase-3蛋白的表達顯著升高，細胞凋亡率顯著升高，細胞存活率顯著降低（P＜0.05）。

圖3 過表達miR-31對OA軟骨細胞中炎癥因子表達的影響（±s，n=9）Fig.3 Effect of overexpressing miR-31 on expression of inflammatory factors in OA chondrocytes（±s，n=9）

圖4 miR-31靶向調控IL-34Fig.4 miR-31 targeted regulation of IL-34

2.6 過表達I L-34能逆轉miR-31對OA軟骨細胞中炎癥因子表達的影響 見圖6，與模型+miR-31+pcDNA3.1組比較，模型+miR-31+pcDNA3.1-IL-34組軟骨細胞TNF-α和IL-6的表達顯著升高（P＜0.05）。

圖5 過表達IL-34能逆轉miR-31對OA軟骨細胞增殖（A）、凋亡（B、C）及P21、Caspase-3蛋白表達（D、E）的影響Fig.5 Overexpression of IL-34 can reverse effect of miR-31 on OA chondrocyte proliferation（A），apoptosis（B，C）and P21，Caspase-3 protein expression（D，E）

圖6 OA軟骨細胞中炎癥因子的表達Fig.6 Expression of inflammatory factors in OA chondrocytes

3 討論

OA的發生是一個涉及多種因素的復雜過程，其中軟骨細胞在OA的發病機制中起著非常重要的作用。因此，研究軟骨細胞增殖、凋亡炎癥反應的分子機制對尋找有效的OA治療方法具有潛在的意義。

近年來，miRNA在OA中的作用備受關注，許多特異性的miRNA被證實在OA發病過程中起關鍵作用［8］。例如，miR-15a-5p通過靶向血管內皮細胞生長因子A來調節人OA軟骨細胞的活力和基質降解［9］。miR-34a已被證實通過促進軟骨細胞凋亡和衰老來促進OA的發展［10］。miR-31是腫瘤生物學中被廣泛研究的miRNA之一，其調控模式和功能因腫瘤類型的不同而不同［11-12］。最近研究表明miR-31可促進軟骨細胞增殖和遷移，但miR-31在OA中的作用并未完全闡明［13］。本研究顯示IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-31的表達顯著降低，與既往研究結論基本吻合。進一步功能分析顯示，在IL-1β誘導條件下過表達miR-31可減少促凋亡蛋白Caspase-3和增殖抑制蛋白P21的水平，提高軟骨細胞存活率，抑制細胞凋亡［14］。在OA發展過程中，大量細胞因子尤其是炎癥因子參與調節和維持關節軟骨的動態平衡，炎癥因子的持續刺激促進軟骨降解［15］。本研究中IL-1β誘導可顯著提高軟骨細胞中炎癥因子TNF-α和IL-6的水平，而過表達miR-31則減輕IL-1β對軟骨細胞炎癥因子表達的促進作用。提示miR-31對OA軟骨細胞具有保護作用。

IL-34是一種新型細胞因子，其通過與巨噬細胞集落刺激因子受體結合，調控單核吞噬細胞系細胞分化、增殖和存活［16］。先前研究顯示血清和滑膜液中IL-34水平的升高與膝OA患者的放射學和癥狀嚴重程度顯著相關［17］。在類風濕關節炎患者血清IL-34也呈高表達，IL-34可能在類風濕關節炎患者骨質疏松的發生發展中扮演著重要作用［18］。此外，有報道稱赤雹根總皂苷通過抑制血液和滑膜組織中IL-34的表達可能對Ⅱ型膠原誘導性關節炎具有治療作用［19］。本研究顯示IL-1β誘導的軟骨細胞中IL-34 mRNA的表達顯著升高，與miR-31表達模式呈負相關關系。本研究顯示過表達miR-31可降低IL-34-3'UTR報告基因熒光素酶活性，且在軟骨細胞中負調控IL-34表達，與既往研究結論相吻合［20］。此外，本研究發現過表達IL-34還可逆轉miR-31對IL-1β誘導的軟骨細胞存活、凋亡以及TNF-α和IL-6表達的影響。提示miR-31通過靶向IL-34具有促進OA軟骨細胞存活，抑制細胞凋亡，減輕炎癥損傷作用。

綜上所述，miR-31通過靶向IL-34可促進OA軟骨細胞增殖，抑制細胞凋亡和炎癥因子分泌。因此，miR-31和IL-34有望成為OA治療的潛在靶點。