水稻OsENOD93b基因組織表達模式與生物信息學分析

何雨航 杜易桓 郭昊 趙頔 馬銀花

摘要：主要探究OsENOD93b基因在水稻中的組織表達模式，并對其作生物信息學分析。采用實時熒光定量PCR技術分析OsENOD93b基因的表達模式。用ExPASy-Protparam、Protscale、CDD、SOPMA、Phyre 2、Psort等在線工具對OsENOD93b進行生物信息學分析。經(jīng)組織表達模式分析可知，OsENOD93b基因在葉片中的含量最多，其次是莖，含量最少的為根。通過ExPASy-Protparam分析發(fā)現(xiàn)，OsENOD93b分子量為16.429 89 ku，是一種具有親水性的不穩(wěn)定的堿性蛋白。該蛋白屬于ENOD93超級家族。通過SOPMA在線軟件對OsENOD93b蛋白的二級結構進行分析預測，發(fā)現(xiàn)其由無規(guī)則卷曲（41.56%）、α-螺旋（39.61%）、延伸鏈區(qū)（14.94%）和β-轉角（3.90%）4種形式組成。此外，利用不同在線工具對OsENOD93b蛋白的三級結構、保守區(qū)域、亞細胞定位進行生物信息學分析。結果表明，OsENOD93b基因在進化過程中具有一定的保守性，并有多樣的潛在功能待研究。研究結果為進一步探明OsENOD93b基因的生物學功能提供了依據(jù)。

關鍵詞：水稻;ENOD;OsENOD93b;組織表達模式分析;生物信息學

中圖分類號： Q78文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）07-0067-04

收稿日期：2020-08-25

基金項目：湖南省自然科學基金（編號：2019JJ50281）;湖南省教育廳項目（編號：18B455）;國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃平臺項目（編號：201910553027X ）。

作者簡介：何雨航（1999—），女，湖南邵陽人，主要從事水稻遺傳及轉基因方面的研究。E-mail：1835147713@qq.com。

通信作者：馬銀花，博士，講師，主要從事水稻遺傳及轉基因方面的研究。E-mail：mayinhua1988@126.com。

水稻（Oryza sativa L.）是稻屬谷類作物，這類經(jīng)濟作物需要吸收氮素合成自身需要的營養(yǎng)物質，因此對水稻結瘤固氮潛能進行研究具有重大的經(jīng)濟意義[1-2]。生物學上一般把宿主植物基因編碼的根瘤特異性蛋白統(tǒng)稱為結瘤素，編碼這些物質的基因稱為結瘤素基因[3]。按照結瘤素基因出現(xiàn)的早晚和功能不同，將其分為早期結瘤素基因、晚期結瘤素基因[4-5]。根據(jù)不同結瘤基因突變體對結瘤過程的影響，將結瘤基因分為共同結瘤基因、寄主專一性基因、調節(jié)基因三大類[6]。早期結瘤素基因參與根瘤菌的侵染和根瘤發(fā)育過程，而晚期結瘤素基因主要負責根瘤的功能[7]。早期結瘤素基因包括豌豆（Pisum sativum L.）中的PsSYM10、PsENOD5、PsENOD12A，大豆[Glycine max （Linn.） Merr.]中的ENOD2B、蠟梅[Chimonanthus praecox （Linn.） Link.]中的CpNOD等。晚期結瘤素基因有紫云英（Astragalus sinicus L.）的AsⅡC259、AsG2511、AsNODF32及百脈根（Lotus corniculatus Linn.）的LjCyp5等[8-15]。到目前為止，大豆早期結瘤素中研究得最清楚的是N-75基因，晚期結瘤素中研究得較清楚的是豆血紅蛋白，它是豆科植物根瘤內的一種血紅蛋白，主要功能是運輸氧、降低擬菌體周圍的氧分壓[4]。

利用ENODZ的mRNA作探針進行研究發(fā)現(xiàn)，在豌豆、菜豆及苜蓿中都有1段與ENODZ同源的基因。另外有據(jù)報道顯示，不同宿主植物內含有的早期結瘤素基因的類型不同，但均含有Enod2、Enod5、Enod12、Enod40[16-17]。ENOD93就是一種早期結瘤素，它在根瘤形成過程中的作用機制及在非豆科植物中的功能并不明確，還有待進一步的研究[4]。此外，Sym（symbiotic）基因也屬于早期結瘤素基因，它是一類存在于豌豆中的共生基因[18]。

研究人員利用生物信息學方法證明，水稻基因組有31個基因與結瘤素基因具有高度同源性，如水稻基因CAC39050、S23543、BAB63833、BAB93352與結瘤素基因的同源性高達70%以上[7]。據(jù)報道，大豆早期結瘤素基因Gmenod40和水稻早期結瘤素基因Osenod40的表達模式相似[19-20]。此外，已發(fā)表的文獻顯示，豆科植物苜蓿的早期結瘤索基因Mrenod40在水稻、苜蓿中的表達方式相同[2，21]。水稻結瘤素的研究對于提高水稻產(chǎn)量和經(jīng)濟價值有著舉足輕重的作用，發(fā)現(xiàn)更多具有特異性功能的結瘤素家族成員也是目前研究的重要任務。

本試驗以水稻為研究對象，對篩選出的OsENOD93b（LOC_Os02g13380）進行理化性質分析與親水性疏水性、保守區(qū)域、蛋白二級、三級結構預測，并進行亞細胞定位，以期為深入研究該基因提供理論依據(jù)，豐富水稻結瘤素基因家族的種類。

1 材料與方法

1.1 OsENOD93b蛋白的生物信息學預測

OsENOD93b蛋白的理化性質使用線上工具ExPASy-Protparam進行分析;親水性、疏水性使用Protscale線上軟件進行分析;蛋白保守功能區(qū)通過CDD軟件進行在線分析;蛋白二級結構使用線上工具SOPMA進行分析;蛋白三級結構通過Phyre 2軟件進行預測，蛋白亞細胞定位使用在線網(wǎng)站 Psort進行分析。上述各軟件的網(wǎng)址見表1[22]。

1.2 OsENOD93b組織表達模式分析

首先進行水稻各組織器官總RNA的提取，其次，將獲得的RNA進行反轉錄形成cDNA，以此進行組織表達模式分析，具體步驟參考Ma等的方法[23-24]。

2 結果與分析

2.1 OsENOD93b蛋白理化性質分析與親水性預測

ExPASy-Protparam線上軟件的分析結果表明，OsENOD93b是1個由154 個氨基酸構成、分子式為C711H1 181N227O210S5、相對分子量為16.429 89 ku、理論等電點（theoretical pI）為11.42的蛋白質。該蛋白質富含強堿性氨基酸[包括精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）等，共計23 個]，且含有大量強酸性氨基酸[包括天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu），共計9個]。OsENOD93b蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為67.09，表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，其脂肪系數(shù)為 81.88。表2關于氨基酸組成的分析結果顯示，丙氨酸（Ala）、精氨酸、絲氨酸（Ser）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）所占比例較高，分別為14.9%、104%、9.1%、7.1%、7.1%、6.5%、6.5%，色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）所占比例較低，都為0.6%。用Protscale線上工具對OsENOD93b蛋白的親水性進行預測，發(fā)現(xiàn)OsENOD93b蛋白的氨基酸組成中既有親水氨基酸，又有疏水氨基酸（圖1），其中主要包含親水性氨基酸，因此判斷該蛋白為親水性蛋白。綜上，OsENOD93b蛋白是1個具有親水性的不穩(wěn)定的堿性蛋白。

2.2 OsENOD93b蛋白的保守域

用CDD在線軟件對OsENOD93b蛋白的保守功能域進行預測，由圖2可知，OsENOD93b基因的特定匹配（specific hits）和非特定匹配（non-specific hits）都在ENOD93，且該蛋白屬于ENOD93 superfamily（ENOD93超級家族）。

2.3 OsENOD93b蛋白的二級結構

利用線上工具SOPMA預測OsENOD93b蛋白的二級結構。由圖3可以看出，OsENOD93b蛋白的二級結構主要由無規(guī)則卷曲（41.56%）、α-螺旋（39.61%）、延伸鏈區(qū)（14.94%）和β-轉角（390%）組成。因此可知，該蛋白的空間構象可能主要由無規(guī)則卷曲結構構成。

2.4 OsENOD93b蛋白的三級結構預測

利用線上工具Phyre2預測OsENOD93b蛋白的三級結構。由圖4可以看出，該蛋白只含有1條肽鏈，沒有三級結構，說明該蛋白空間構象較簡單，且不能折疊形成特異的空間構象。

2.5 OsENOD93b蛋白的亞細胞定位

通過線上工具Psort對OsENOD93b蛋白進行亞細胞定位，結果（表3）表明，該蛋白定位在線粒體的可能性為30.4%，定位在細胞質的可能性為26.1%，定位在細胞核、內質網(wǎng)、高爾基體、液泡、分泌系統(tǒng)囊泡、細胞外（包括細胞壁）等地方的可能性分別為 8.7%、8.7%、8.7%、8.7%、4.3%、4.3%。根據(jù)上述數(shù)據(jù)推測，OsENOD93b蛋白定位在線粒體的可能性最大，其次是細胞質，也可能是胞核、內質網(wǎng)、高爾基體、液泡、分泌系統(tǒng)囊泡和細胞外（包括細胞壁）。

2.6 OsENOD93b基因組織表達模式分析

首先，通過特定方法提取水稻根、莖、葉的RNA，將其反轉錄成cDNA。其次，利用實時熒光定量PCR的方法，檢測OsENOD93b基因在不同組織器官中的表達水平。研究結果顯示，OsENOD93b 基因的總體表達水平相對較高，在根、莖、葉器官中均有表達，在葉中的表達量最高，其次是莖中，表達量最少的為根中（圖5）。上述結果表明，OsENOD93b的功能在不同植物中可能具有一定的潛在多樣性。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，OsENOD93b在水稻根、莖、葉中有不同水平的表達，在葉中的表達量最高，在根、莖中的表達量相對較低。但是根據(jù)其在各組織中均有表達，且相對表達量較高的情況來看，OsENOD93b基因在水稻早期結瘤素家族中有著舉足輕重的地位。因此，對OsENOD93b表達的特異性進行詳細研究，有助于探明OsENOD93b蛋白功能的特異性。

生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，OsENOD93b蛋白是一個親水的、不穩(wěn)定的堿性蛋白，屬于ENOD93 superfamily（ENOD93超級家族）。蛋白二級結構預測發(fā)現(xiàn)，該蛋白晶體的空間構象可能是以無規(guī)則卷曲結構構成的;OsENOD93b蛋白沒有三級結構，由1條鏈組成;此外，OsENOD93b蛋白定位預測結果表明，它定位于線粒體的可能性最大，比定位在細胞質的可能性更大。由此可見，OsENOD93b蛋白極有可能在線粒體中表達其功能。但目前尚未發(fā)現(xiàn)OsENOD93b在線粒體中的詳細功能。后續(xù)將對OsENOD93b進行功能性研究，以期發(fā)現(xiàn)對未來新型水稻品種有利的功能。

4 結論

組織表達模式分析結果表明，OsNOD93b參與各組織的表達，在葉中的表達明顯。通過ExPASy-Protparam在線軟件預測可知，OsNOD93b是一個具有親水性、保守的、堿性的、不穩(wěn)定的蛋白分子，亞細胞定位預測結果顯示，該蛋白可能在定位線粒體中，以高水平、保守的方式調控水稻的重要生物學功能及作用機制。

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