靜電紡絲絲素蛋白納米纖維在骨組織工程中的運用

向 靜，李玲婕，李雨舟，張 赫，季 平，楊 生

（重慶醫科大學附屬口腔醫院，重慶市口腔疾病與生物醫學重點實驗室，重慶，401147）

意外事故、腫瘤切除、骨發育不全等造成的大面積骨缺損嚴重影響人體美觀、功能等，常常需要進行人工骨移植或骨重建進行修復。人工骨移植包括異體骨移植和自體骨移植，異體骨具有免疫原性，而自體骨則來源有限[1]。因此，1987年提出的“骨組織工程”成為修復骨缺損的新興方法得到了廣泛關注[2]。骨組織工程（tissue engineering，TE）由支架、細胞、生長因子及其在微環境中的相互聯系組成，其中，構建理想的支架材料提高骨再生的效果是骨TE的核心問題。絲素蛋白（silk fibroin，SF）已被證明是一種極具前景的支架材料，其良好的生物相容性、優異的力學性能和低免疫原性決定了其在骨TE的重要性和應用潛能。本文就電紡SF納米纖維在骨TE中的運用進展作一綜述。

1 SF

SF是一種天然生物蛋白，來自于產絲節肢動物的腺體，包括蜘蛛，蠶等。使用最多最普遍的家蠶B.mori絲素蛋白，其蛋白結構如示意圖1所示，由～26 kDa輕鏈（L鏈）和～390 kDa重鏈（H鏈）通過二硫鍵相互連接構成[1]。SF具有3種典型的結構[3]，其中，亞穩態的親水性結構silk I可以通過改變溫度或添加有機溶劑（如甲醇）等方式轉變為疏水性結構silk II；silk III則是一種在空氣和水界面自組裝形成的三倍體螺旋結構[4]。SF具有良好的機械性能，包括300～740MPa的拉伸強度、62,104J/kg的韌性、10-17GPA的拉伸彈性模量以及4%-26%的斷裂應變強度。此外，SF還具有良好的生物相容性，1993年，美國食品和藥物管理局（FDA）定義SF為安全的生物材料，并廣泛應用于縫合等醫學領域[5]。不僅如此，SF還具有可控的生物降解性、良好的氧氣和水蒸氣滲透性等，在生物技術、材料科學、醫學美容等領域都有廣泛應用[6-7]。

圖1 絲素蛋白的結構示意圖[7]

2 靜電紡絲

靜電紡絲技術起源于20世紀初，其原理是粘彈性溶液在高靜電力下被擠壓成射流，形成連續的納米/微米纖維。靜電紡絲的基本裝置如圖2所示，包括高壓電源、注射泵、旋轉的聚合物溶液和接收裝置。研究表明，電紡參數對纖維的形態結構有一定影響，比如聚合物性質、溶劑性質、溶質性質、加工環境條件以及電紡溶液的濃度、分子量、粘度和流速等[8]。電紡參數對纖維形態的影響在表1總結如下。

3 絲素蛋白靜電紡絲

SF靜電紡絲，常用六氟異丙醇（HFIP）、甲酸（FA）和水溶液三種溶劑。首先，HFIP有機溶劑，具有很好的粘彈性，7%(w/v)的SF-HFIP即可形成纖維，平均直徑6.5～100nm[10]；通過β折疊后，SF-HFIP納米纖維具有良好的機械性能[11]。FA作溶劑,5%～20%的SF-FA溶液制備的纖維直徑在12-1500nm之間[12];甲醇溶液誘導SF β折疊后，膜的孔隙率從76.1%下降到68.1%，膜的機械性能增強[13]。Zhang et al.比較HFIP和甲酸兩種溶劑對SF纖維形態、結構和細胞毒性的影響發現，相同條件下SF-HFIP制備的纖維直徑平均約2um，而SF-FA平均直徑約0.3um，且SF-FA納米纖維膜結晶度更高，但兩種膜對人表皮細胞(NHEF)粘附生長的影響沒有明顯區別[14]。

HFIP和FA都是有機溶劑，殘留在體內可能產生負作用，因此一些研究探討了對人體最安全的溶劑-水對SF電紡纖維的影響。SF-水作為電紡溶液，可紡性差。Wang et al.利用28w/v% SF-水溶液電紡制備的纖維直徑400～800nm，而濃度低于17%的SF-水溶液不能形成纖維[15]。但是，研究表明高濃度的SF-水溶液容易通過氫鍵和疏水作用等相互作用轉化為凝膠，不利于加工操作[16]。因此，為改善SF-水溶液的電紡性，Jin et al.提出在SF-水溶液中加入聚氧化乙烯(PEO)[17]。研究表明，5(wt)%的PEO溶液與8(wt)%的SF按4∶1(wt/wt)比例混合形成的7.5wt% SF-PEO溶液具有良好的可紡性，制備的纖維直徑平均約800nm，且具有良好的機械性能[18]。Kishimoto et al.通過改進提取SF的方法，在無PEO等水溶性聚合物共存的情況下，以小于10wt%的SF-水溶液進行電紡，制備的SF膜具有良好的機械性能和生物相容性。綜上，無論采用何種溶劑，SF電紡可行性高，且制備的SF納米纖維膜具有良好的機械性能和生物相容性，因此，在骨TE具有較大的應用前景[19]。

4 絲素蛋白電紡納米纖維在骨組織工程的應用

4.1 成骨相關細胞和絲素蛋白電紡納米纖維間的相互作用

雖然SF的蛋白序列中沒有任何細胞特異性結合位點，SF納米纖維膜依然能促進間充質干細胞(MSCs)的粘附和增殖。首先，電紡SF納米纖維膜具有高比表面積，能夠促進蛋白黏附和細胞附著，為骨細胞的鋪展生長奠定基礎[9]。其次，通過調節電紡參數可以調控SF納米纖維膜的孔徑、孔隙率以及生物活性等，更好的模擬骨細胞生長微環境，促進成骨相關細胞的增殖分化[20]。Won Seo et al.研究表明SF納米纖維膜增強了小鼠前體成骨細胞（MC3T3-E1）的ALP活性，促進了細胞成骨分化[21]。Nikbakht et al.通過體外培養BMSCs 12d證明SF促進了BMSCs礦化[22]。研究表明，SF調控干細胞成骨分化的機制主要通過以下途徑：Wnt、Notch、成纖維細胞生長因子(FGF)、骨形態發生蛋白/轉化生長因子β(BMP/TGFβ)、胰島素樣生長因子(IGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)等[23]。根據藥理學和分子學的研究，Notch信號在MSCs向成骨細胞分化過程中起重要作用，SF通過抑制Notch信號而上調一些成骨細胞分化標記物(如ALP,osteorix和Runx2)的表達[24]。以上研究表明，SF對成骨相關細胞的作用非常明顯，因此，其在骨TE中的具有較大的應用前景。

表1：電紡參數及其對納米纖維形態的影響。

圖2 a)電紡裝置示意圖，包括一個裝溶液的注射器，一個可控速度的注射器泵，以及一個高壓電源。通過施加合適的電壓，形成泰勒錐，射流噴射到集電極板上。b)電壓升高對泰勒錐(深色尖端)形成的影響。在低電壓下，首先形成垂墜，然后在尖端形成錐體，電壓持續增大，在針尖處形成錐形，更高的電壓觸發纖維形成[9]。

4.2 破骨細胞和電紡絲素納米纖維間的相互作用

在骨組織工程中，骨形成細胞在支架上成骨向分化并礦化，促進骨再生非常重要。但是，骨重建是一個骨形成和骨吸收平衡的過程，在骨再生過程中，不僅需要考慮骨形成細胞而且還要考慮骨吸收細胞。目前為止，只有少數文獻涉及破骨細胞和SF納米纖維膜之間的相互作用。通過蒸汽β折疊的SF和甲醇折疊的SF薄膜單培養或共培養小鼠成骨細胞和破骨細胞發現，單獨培養單核細胞時，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）陽性的細胞出現聚集；而破骨細胞和成骨細胞共培養時，TRAP陽性細胞均勻分布，表明絲素蛋白可能是研究破骨細胞和成骨細胞之間細胞-細胞交流的有利生物材料[25]。相反，SF水解產物以時間和劑量依賴方式抑制鼠單核巨噬細胞系RAW 264.7細胞中RANKL誘導的TRAP的形成[5]。目前尚不清楚在SF支架上培養破骨細胞過程中，存在多少絲素蛋白的裂解產物，但是，絲素蛋白的裂解物可以用作天然化合物通過減少破骨細胞生成來防止骨質流失。

4.3.電紡絲素納米纖維作為支架參與體內骨再生

臨床應用中，生物材料的應用不能僅通過體外測試來評估，因為很難從體外情況推至體內。因此，骨TE中骨科材料的生物相容性和骨再生能力也應在體內研究中體現。為了評估SF納米纖維支架的體內骨再生能力，已在不同動物模型中進行測試，主要包括小鼠、大鼠、兔和綿羊等的顱骨、下頜或股骨缺損等。Jwa-Young Kim et al.利用大鼠顱骨臨界缺損模型研究了BioGide膜和SF膜在骨再生中的差異。Bio-Gide膜主要是I型膠原，其中存在GER肽序列(GFP*GERGVEGPP*GPA)，是α2β1整合素結合的必要識別位點，在介導成骨細胞分化中發揮重要作用。然而，體內研究表明，材料植入8周后，SF和商業Bio-Gide膠原膜（分別為8.75±0.80和8.47±0.75 mm3）的骨再生的能力沒有明顯差異[26]。此外，SF納米纖維膜降低了傳播感染的風險，為促進骨再生提供了另一種選擇。另一研究制備的SF納米纖維膜具有良好的生物相容性，在兔顱骨缺損模型中，體內植入8周后觀察到骨愈合[27]。用于頜面骨再生的SF納米纖維膜通過螺釘植入大鼠股骨缺損模型中，術后8周觀察到令人滿意的骨重建[28]。以上研究表明，SF在體內亦具有良好的骨再生性能。

4.4 電紡絲素納米纖維作為成骨藥物的載體

近年來，靜電紡絲法制備的SF納米纖維已被用于骨TE。然而，SF本身并不具有成骨性能，因此，有必要加入合適的成骨因子提高骨再生效果，比如骨特異性生長因子（BMP-2，血小板衍生生長因子PDGF）、基因和酶等[29]。Shalumon采用靜電紡絲法制備了SF/殼聚糖/納米羥基磷灰石/骨形態發生蛋白-2 (SF/CS/nHAp/BMP-2,SCHB2)支架[30]，BMP-2包裹在納米纖維的芯層，而殼層由兩種厚度的SF/CS/nHAp組成。與純SF/CS和SF/CS/nHAp相比，BMP-2結合的SCHB2納米纖維能更好的誘導BMSCs成骨向分化。盡管BMP-2在誘導骨代謝和再生方面效果很好，但高濃度的BMP-2可能導致免疫原性、異位骨修復和水腫等[9]。因此，P24(S[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYLDDD)，一種新的氨基酸多肽已被用作BMP-2的替代品用于骨TE[31]。研究表明，將P24經氧化石墨烯(GO)修飾后（GO-p24）組裝到SF/CS納米纖維表面,避免了P24的局部快速擴散，促進了細胞的黏附[32]。最近，通過靜電紡絲法制備了聚谷氨酸結合BMP-2肽(E7-BMP-2)修飾的SF/PCL納米纖維膜，研究表明，脂肪組織源性干細胞(ADSCs)在E7-BMP-2肽修飾支架上具有良好的成骨分化能力[33]。

小分子也可以用作有效的骨誘導因子，因為它們的分子質量較低(＜1000 Da)，不會激發宿主的免疫反應，可以有效緩解使用蛋白質和多肽帶來的難題[34]。例如，瑞舒伐他汀(RSV)是一種弱親水性小分子藥物，與其他他汀類藥物如阿托伐他汀和辛伐他汀相比，在骨誘導方面表現出了巨大的潛力[35]。此外，添加蕁麻(Urtica dioica L.，)這種成骨因子，增加了SF納米纖維的直徑，且以劑量依賴的方式促進了ALP、Runx2、Col I和OCN等成骨分化相關基因的表達，促進了hADSCs的成骨分化[36-37]。

5 展 望

大面積骨缺損嚴重影響人體美觀、功能運動，骨TE成為修復治療骨缺損的重要方法之一。電紡SF納米纖維在形態結構和生物活性等方面具有可調性，比如與生物材料（如nHA）結合，形成復合支架，模仿天然骨骼環境，增加支架的成骨能力，這使它們成為骨TE應用優先考慮的候選材料。但是SF作為一種天然聚合物，其性質因來源而異，且不同的脫膠過程和制造方法以及電紡參數的控制都可能改變材料的性能。此外，盡管許多研究證實了SF納米纖維膜在體內具有誘導成骨的潛力，但這些研究大多是在小動物模型上進行的，因此結果可能不能完全推廣到人類使用。未來還需要進行更多的研究，以確定在臨床試驗中使用SF納米纖維支架的安全性，并構建適合的用于骨組織再生的商業化產品。