Let-7f-5p對糖尿病大鼠心肌微血管病變的影響及機制

黃河，周瑞，劉星，劉應才

西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000

心肌組織具有極其豐富的毛細血管網，能夠顯著影響心肌灌注。糖尿病心肌微血管病變造成心肌微血管密度減少，引起心臟灌注不足，導致心血管不良事件的發生［1］。因此，治療糖尿病微血管病變、改善心肌微血管功能對于建立缺血心肌側支循環、改善患者預后十分重要。但目前對糖尿病微血管病變尚無有效的治療措施。有研究顯示，局部補充血管內皮生長因子（VEGF）可增加糖尿病心肌微血管密度，改善心功能［2-3］。微小RNA（miRNA）是一種單鏈、非編碼的內源性非編碼RNA，其主要作用是通過降解mRNA或翻譯抑制，從而在轉錄后調節基因的表達。在心血管系統中，miRNA通過調節基因表達在心肌細胞生長、心率維持、血管生成方面起重要作用［4］。Let-7是目前研究最廣泛的mi RNA家族之一，其在心血管系統中高度表達，與心臟肥厚、心臟纖維化等病理過程以及擴張型心肌病、心肌梗死、心律失常、高血壓病等心血管疾病密切相關［5］。同時，Let-7可調控血管生成，Let-7能夠以Argonaute蛋白1（AGO1）為靶點介導VEGF的產生，即Let-7/AGO1/VEGF信號通路，最終促進血管生成［6-7］。但Let-7/AGO1/VEGF信號通路是否在糖尿病心肌微血管病變中同樣能起到血管生成作用，從而改善心肌微血管病變，目前尚不明確。Let-7f-5p是Let-7家族成員，其與心肌缺血、維持血管完整性等關系密切，但其在糖尿病微血管病變中的作用鮮見報道。我們的前期研究顯示，糖尿病大鼠心肌組織Let-7f-5p表達較正常對照組明顯下降［8］。2019年10月—2020年4月，我們通過腺病毒轉染的方式分別上調和下調糖尿病大鼠心肌組織Let-7f-5p表達，觀察AGO1和VEGF在mRNA及蛋白水平的變化，觀察Let-7f-5p對心肌微血管病變的影響并探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級健康雄性SD大鼠25只，6～8周齡，體質量（200±20）g，購自西南醫科大學實驗動物中心。飼養房空氣流通，溫度22～26℃，光照時間12 h/d。普通飼料，自由飲水，適應性喂養1周后用于實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器 Let-7f-5p過表達及干擾表達腺相關病毒載體委托北京邁津生物科技公司構建。空病毒原液構自北京邁津生物科技公司。羅氏血糖儀、血糖試紙（德國羅氏公司）；鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司）；兔來源CD31抗體（Afinity公司）；總RNA提取試劑、RT-PCR反轉錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒（ELK Biotechnology）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、ECL化學發光檢測試劑盒、蘇木素染液、伊紅染液（ASPEN公司）。GE Vivi-E9心血管超高端彩超（美國GE公司）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；熒光定量PCR儀（Life technolo?gies）；電泳儀（北京市六一儀器廠）；酶標儀（Diatek公司）；普通光學顯微鏡（OLYMPUS公司）。

1.2 動物分組與模型建立 將大鼠隨機分為正常對照組5只和糖尿病模型組20只。正常對照組實驗全程予以自由飲水、常規飼料喂養。糖尿病模型組給予高脂高糖飼料（配方為10%豬油、20%蔗糖、6%蛋白粉、3%蛋黃粉、61%常規飼料）喂養4周后，禁食12 h，腹腔注射40 mg/kg STZ；注射72 h后，使用羅氏快速血糖儀行尾靜脈血糖檢測，以3次隨機血糖值>16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型構建成功。取造模成功的大鼠15只，隨機分為空病毒組、Let-7f-5p過表達組、Let-7f-5p抑表達組，每組各5只。

1.3 干預方法 Let-7f-5p過表達組尾靜脈一次性注射Let-7f-5p過表達病毒原液50μL，Let-7f-5p抑表達組尾靜脈一次性注射Let-7f-5p抑制表達病毒原液50μL，空病毒組尾靜脈一次性注射等體積空病毒原液。隨后三組大鼠繼續自由飲水、高脂高糖飼料喂養12周。

1.4 心臟功能檢查 所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，剪去胸前區毛發，涂抹適量醫用超聲耦合劑，使用彩色多普勒超聲顯像儀（GE Vivid E9）進行心臟超聲檢查。探頭頻率3.5 MHz，記錄左心室舒張末期內徑（LVIDd）、左心室收縮末內徑（LVIDs），計算左心室射血分數（LVEF）、左心室縮短分數（FS）。

1.5 標本采集 大鼠固定，開胸取出心臟，剪去多余血管和心房組織。取左心室心肌組織，分成約5 mm×5 mm×3 mm若干小塊，一部分加入4%多聚甲醛固定，用于免疫組化；另一部分置于-80℃冰箱保存，用于RT-PCR和Western blotting檢測。

1.6 心肌毛細血管密度檢測 采用兔來源CD31單抗免疫組化染色。取4%多聚甲醛固定的心肌組織，石蠟包埋，常規脫蠟、水化，取心肌橫切面切片，置于3%H2O2中，室溫避光孵育。加入兔來源CD31一抗50μL，4℃過夜。每張切片加100μL HRP標記山羊抗兔二抗，37℃孵育50 min。DAB染色，蘇木素復染。顯微鏡下觀察抗CD31抗體染色陽性的心肌毛細血管數量。從每個切片中隨機選取5個區域，由兩名經驗豐富的觀察者計數毛細血管數量和心肌細胞核，計算毛細血管數量/心肌細胞核比值（C/M），取平均值用于評估心肌毛細血管密度。

1.7 心肌組織Let-7f-5p及AGO1、VEGF mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取凍存心肌組織約20 mg，加入1 mL預冷的TRIpure充分研磨，至心肌組織全部溶解。采用TRIzol法提取心肌組織RNA，反轉錄合成cRNA。以cDNA為模板，使用StepOne?Real-Time PCR儀進行PCR擴增。引物序列見表1。反應體系：2×Master Mix 5μL，2.5μmol/L引物工作液1μL，Template 1μL，ddH2O 2μL，ROX參比染料1μL。反應條件：95℃預變性10 min；95℃15 s，60℃60 s，共40個循環。采用2-ΔΔct法計算目的基因的相對表達量，let-7f-5p以U6為內參進行計算，AGO1、VEGF mRNA以GAPDH為內參進行計算。

表1 目的基因及內參引物序列

1.8 心肌組織AGO1、VEGF蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取心肌組織勻漿，加入適當細胞總蛋白提取試劑，振蕩、吹打，使細胞完全裂解。4℃、13 000 g離心5 min，收集上清液，使用BCA法測定蛋白濃度。根據樣品濃度確定上樣量，保證每個樣品總蛋白上樣量均為40μg。將處理完畢的蛋白樣品通過電泳電轉至PVDF膜上，加入封閉液，室溫封閉1 h。加入一抗（稀釋比例1∶1 000）4℃過夜。TBST沖洗，加入二抗（稀釋比例1∶10 000），室溫孵育30 min。TBST沖洗。滴加新鮮配制的ECL混合溶液到膜的蛋白側，暗室中曝光。根據不同的光強度調整曝光條件，顯影、定影。將膠片進行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統分析目標帶的光密度值，用GAPDH條帶進行灰度值校正。以各條帶與GAPDH條帶的吸光度之比計算目的蛋白的相對表達量。

1.9 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心臟功能指標比較 與對照組相比，空病毒組、Let-7f-5p過表達組、Let-7f-5p抑表達組LVIDd、LVIDs、LVEF、FS均降低（P均<0.05）。Let-7f-5p過表達組LVIDd、LVIDs、LVEF、FS較空病毒組增加，Let-7f-5p抑表達組LVIDd、LVIDs、LVEF、FS較空病毒組降低（P均<0.05）。見表2。

2.2 各組心肌微血管密度比較 空病毒組、Let-7f-5p過表達組、Let-7f-5p抑表達組、對照組C/M分別為0.48±0.07、0.66±0.05、0.28±0.05、1.49±0.28。與對照組比較，其他三組C/M均降低；與空病毒組比較，Let-7f-5p過表達組C/M增加，Let-7f-5p抑表達組C/M降低（P均<0.05）。

表2 各組心臟功能指標比較（±s）

表2 各組心臟功能指標比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與Let-7f-5p過表達組比較，#P<0.05；與空病毒組比較，△P<0.05。

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2.3 各組心肌組織中Let-7f-5p及AGO1、VEGF mRNA表達水平比較 與對照組相比，空病毒組、Let-7f-5p抑制表達組心肌組織Let-7f-5p及VEGF mRNA表達均降低，AGO1 mRNA表達升高（P均<0.05）；與空病毒組比較，Let--7f-5p抑表達組心肌組織Let-7f-5p及VEGF mRNA表達降低，AGO1 mRNA表達升高（P均<0.05）；Let-7f-5p過表達組心肌組織Let-7f-5p及VEGF mRNA表達升高，AGO1 mRNA表達降低（P均<0.05）。見表3。

表3 各組心肌組織中Let-7f-5p、AGO1、VEGF mRNA表達比較（±s）

表3 各組心肌組織中Let-7f-5p、AGO1、VEGF mRNA表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與Let-7f-5p過表達組比較，#P<0.05；與空病毒組比較，△P<0.05。

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2.4 各組心肌組織AGO1、VEGF蛋白表達水平比較 與對照組比較，空病毒組心肌組織AGO1蛋白表達升高，VEGF蛋白表達降低（P均<0.05）；與空病毒組比較，Let-7f-5p過表達組心肌組織AGO1蛋白表達降低、VEGF表達升高，Let-7f-5p抑表達組心肌組織AGO1蛋白表達升高、VEGF表達降低（P均<0.05）。見表4。

表4 各組心肌組織中AGO1及VEGF蛋白表達比較（±s）

表4 各組心肌組織中AGO1及VEGF蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與Let-7f-5p過表達組比較，#P<0.05；與空病毒組比較，△P<0.05。

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3 討論

糖尿病微血管病變可導致心肌灌注不足、心肌能量代謝障礙、心肌肥厚、心室壁硬度增加、心肌收縮和舒張功能障礙等心肌結構和功能障礙，最終導致心力衰竭的發生［9］。VEGF是影響血管生成的主要因素，血管內皮細胞在VEGF的作用下，遷移至血管周圍間隙，再通過黏附、分裂、增殖、重構等過程，最終形成新生的毛細血管［10］。ISNER等［11-12］報道，對下肢慢性缺血性閉塞患者通過肌肉內注射或球囊直接血管內給藥的方式局部補充VEGF，可促進缺血區域的側支循環形成，改善遠端肢體血流，表明通過局部補充VEGF可以改善缺血組織病變。在糖尿病大鼠模型中，增加心臟中VEGF的表達后，大鼠心肌微血管密度增加，心肌血流量提高，最終改善了心臟功能［2-3，13］。這表明局部增加心肌中VEGF的表達可能是糖尿病微血管病變潛在的治療方向。

本研究結果顯示，與對照組比較，LVIDd、LVIDs、LVEF、FS均降低，表明表現為心臟收縮功能減弱，出現了心臟功能障礙；CD31單抗免疫組化染色顯示，心肌微血管密度降低，提示心肌細胞在高血糖環境中受損，證實了糖尿病心肌微血管病變的存在。與空病毒組比較，Let-7f-5p過表達組心肌微血管密度增加，且心臟超聲結果提示心臟收縮功能好轉；而Let-7f-5抑表達組大鼠心肌微血管密度更加稀疏，心臟收縮功能惡化，說明心肌Let-7f-5p可影響糖尿病心肌微血管病變，最終影響心臟功能。

Let-7/AGO1/VEGF是一條促進血管生成的信號通路。有研究顯示，在缺氧情況下，Let-7可靶向抑制AGO1表達。AGO1蛋白屬于AGO蛋白家族，在真核細胞中miRNA與AGO蛋白結合，最終形成RNA誘導的沉默復合體（RISC），RISC再通過靶向調控mRNA，從而對基因進行轉錄后的負性調控［14］。AGO1蛋白是AGO蛋白家族成員，是調控血管內皮細胞內VEGF mRNA轉錄和蛋白質合成的關鍵蛋白［15-17］。其表達抑制導致VEGF mRNA表達上調，VEGF蛋白表達增加，從而使血管生成增多［6-7］。CHEN等［7］研究發現，缺氧狀態下血管內皮細胞中Let-7a、Let-7f等Let-7家族成員miRNA表達明顯上調，VEGF mRNA表達增加；通過生物信息學預測發現，AGO1可能是中間重要的調控位點；分別抑制Let-7表達及過表達AGO1后均可減弱內皮細胞中VEGF的表達。通過動物實驗進行驗證后，最終發現Let-7/AGO1/VEGF信號通路的存在，即當上調Let-7表達后，AGO1表達降低而VEGF表達增加，最終導致血管生成增加。ZHU等［6］發現，低氧處理的人脂肪來源干細胞細胞外囊泡中Let-7f-5p、Let-7a-5p、Let-7i-5p、Let-7c-5p表達增加，進一步阻斷Let-7家族表達，檢測AGO1、VEGF mRNA/蛋白的表達并評估體外促血管生成能力，最終表明Let-7/AGO1/VEGF信號通路可調控血管生成。本研究結果顯示，與對照組比較，空病毒組心肌AGO1 mRNA和蛋白表達升高，VEGF表達降低，表明AGO1蛋白可能通過參與RISC的形成，調控VEGF的表達。與空病毒組比較，Let-7f-5p過表達組心肌AGO1 mRNA和蛋白表達均降低，VEGF mRNA和蛋白表達升高，而Let-7f-5p抑制表達組的檢測結果相反，AGO1 mRNA和蛋白表達水平均升高，VEGF mRNA和蛋白水平降低。這表明上調Let-7f-5p表達可通過抑制AGO1蛋白表達從而增加心肌VEGF表達，增加心肌微血管密度，改善糖尿病大鼠的心臟功能。

綜上所述，Let-7f-5p可能通過Let-7/AGO1/VEGF信號通路調控影響糖尿病大鼠心肌微血管病變，其表達上調可增加糖尿病心肌微血管密度，改善心臟功能，為糖尿病心肌微血管病變的靶向治療提供了思路和方向。