結(jié)直腸癌患者血漿激肽釋放酶B1水平變化及其診斷價(jià)值分析

王渝，何培元，周凡

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000

結(jié)直腸癌（CRC）常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全球各種惡性腫瘤發(fā)病率的第3位，病死率居第2位［1］。研究證實(shí)，大規(guī)模篩查可有效降低CRC的發(fā)病率和病死率［2-4］。目前臨床上廣泛應(yīng)用的CRC篩查手段為糞便潛血試驗(yàn)，雖然操作簡(jiǎn)便，但特異性和敏感性較差；結(jié)腸鏡檢查是確診CRC的可靠手段，但其屬于侵入性檢查，且要求良好的腸道準(zhǔn)備，費(fèi)用高、耗時(shí)長(zhǎng)，不適合作為大規(guī)模的篩查手段。癌胚抗原（CEA）是目前臨床應(yīng)用最廣泛的腫瘤標(biāo)志物之一，也是目前唯一推薦用于監(jiān)測(cè)CRC患者的血液標(biāo)志物［5］。但某些非惡性疾病如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、甲狀腺功能減退癥等疾病患者，其血清CEA水平也會(huì)升高，導(dǎo)致其特異性降低。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的廣泛發(fā)展，許多蛋白質(zhì)分子被證明是潛在的惡性腫瘤生物標(biāo)志物［6］。激肽釋放酶（KLK）具有多種生物學(xué)功能，參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過程［7］。KLKB1是一種絲氨酸蛋白酶，其前體廣泛存在于血液和多種組織中。我們的前期研究顯示，KLKB1是CRC主要異常通路中的關(guān)鍵核心基因［8］。本研究通過觀察CRC患者血漿KLKB1水平的變化，評(píng)估其對(duì)CRC的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2019年10月—2020年10月在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的CRC患者65例（CRC組），男38例、女27例，年齡35～82（61.25±10.03）歲，腫瘤直徑<5 cm 43例、≥5 cm 22例，腫瘤位于結(jié)腸20例、直腸45例，浸潤(rùn)深度T1～T2級(jí)14例、T3級(jí)16例、T4級(jí)35例，分化程度高分化3例、中分化51例、低分化11例，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期32例，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移9例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)腸鏡和手術(shù)病理結(jié)果確診為CRC；新發(fā)腫瘤，未經(jīng)放化療、分子靶向治療；不伴有其他系統(tǒng)腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：具有家族性遺傳性腸道疾病、炎癥性腸??；既往有結(jié)直腸部分切除手術(shù)史；合并嚴(yán)重心肝腎器質(zhì)性疾病。另擇門診健康體檢者20例作為對(duì)照組，男13例、女7例，年齡36～72（56.90±8.74）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者本人知情同意并簽署同意書。

1.2 標(biāo)本采集及處理 采集受試者空腹外周靜脈血2管各5 mL，一管加入EDTA抗凝，低溫高速離心機(jī)，1 000 g離心10 min，獲得血漿；另一管3 000 r/min離心10 min獲得血清，用移液器將上層液吸入1.5 mL EP管中分裝，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ袠?biāo)本均于采血后2 h內(nèi)檢測(cè)完畢。

1.3 血漿KLKB1水平檢測(cè) 采用ELISA法。使用KLKB1試劑盒（CUSABIO，武漢華美生物）測(cè)定血漿KLKB1水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.4 血清CEA水平檢測(cè) 采用免疫熒光法。使用全自動(dòng)生化免疫分析儀（瑞士羅氏公司）測(cè)定血清CEA含量。具體步驟嚴(yán)格按照說明書操作。以CEA<5.0 ng/mL作為臨床參考標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較方差齊時(shí)采用單因素方差分析。使用ROC曲線評(píng)價(jià)KLKB1和CEA對(duì)CRC的診斷效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿KLKB1、血清CEA水平比較 CRC組血漿KLKB1、血清CEA水平均高于對(duì)照組（P均<0.05）。見表1。

表1 兩組血漿KLKB1、血清CEA水平比較（±s）

表1 兩組血漿KLKB1、血清CEA水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

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2.2 CRC患者血漿KLKB1與臨床病理特征的關(guān)系 CRC患者血漿KLKB1水平與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度無相關(guān)性（P均>0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者的血漿KLKB1水平分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期患者（P均<0.01）。見表2。

2.3 KLKB1、CEA對(duì)CRC的診斷價(jià)值 ROC曲線顯示，KLKB1診斷CRC的曲線下面積（AUC）為0.885（95%C I為0.807～0.962），其診斷敏感度為78.5%、特異度為95.0%；CEA診斷CRC的AUC為0.830（95%C I為0.742～0.918），其診斷敏感度為75.4%，特異度為85.0%。

3 討論

早期CRC患者5年生存率超過90%，而合并轉(zhuǎn)移的CRC患者5年生存率僅為14%［9］。研究顯示，近10年來我國(guó)CRC發(fā)病率和病死率均有所上升，而發(fā)達(dá)國(guó)家采取癌癥篩查干預(yù)和管理措施使CRC發(fā)病率和病死率下降［10］。目前尚無一種理想的生物標(biāo)志物用于大規(guī)模篩查以盡早診斷CRC，因此尋找理想的CRC篩查生物標(biāo)志物是非常有必要的。KLKB1與絲氨酸蛋白酶—胰蛋白酶家族的蛋白質(zhì)具有同源性，并且與表面依賴性促凝、纖維蛋白溶解、激肽的產(chǎn)生和炎癥有關(guān)［11］，在高血壓、炎癥、血管功能、血壓調(diào)節(jié)、血栓形成、糖尿病和代謝等方面均有重要作用［12］。新近研究發(fā)現(xiàn)，KLKB1可作為腫瘤診斷的新靶點(diǎn)。PENG等［13］報(bào)道，鼻咽癌患者血漿KLKB1活性明顯增高，認(rèn)為KLKB1可作為診斷鼻咽癌較為特異性的標(biāo)志物。HEO等［11］報(bào)道，KLKB1診斷肺癌的靈敏度為90%、特異性為88%。ADAMO?POULOS等［14］報(bào)道，KLKB1 mRNA在慢性B淋巴細(xì)胞白血病中過表達(dá)，推測(cè)KLKB1可作為臨床診斷白血病的潛在生物標(biāo)志物。目前國(guó)內(nèi)外鮮見關(guān)于KLKB1與CRC關(guān)系的報(bào)道。

表2不同臨床病理特征CRC患者血漿KLKB1水平比較（±s）

表2不同臨床病理特征CRC患者血漿KLKB1水平比較（±s）

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KLKB1由KLKB1單基因編碼，正常情況下在腸道中的表達(dá)含量很低。本研究結(jié)果顯示，KLKB1在CRC血漿中異常高表達(dá)，考慮其在血液中表達(dá)水平升高的原因可能是機(jī)體發(fā)生腫瘤時(shí)引起體內(nèi)凝血途徑異常，炎癥激活，導(dǎo)致在肝臟中合成的無活性前體血漿激肽釋放酶原（PPK）被激活，從而引起釋放入血液循環(huán)的有活性KLKB1增加。KLKB1被激活后產(chǎn)生激肽，激肽除了獨(dú)立介導(dǎo)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的血凝、炎癥激活、血壓調(diào)節(jié)、血栓形成風(fēng)險(xiǎn)的調(diào)節(jié)，還參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖過程。KLKB1在CRC血漿中的異常高表達(dá)在其他惡性腫瘤如肺癌、鼻咽癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病中高表達(dá)的結(jié)果相一致。

進(jìn)一步分析CRC患者血漿KLKB1與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示CRC患者血漿KLKB1表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者的血漿KLKB1水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期患者，而臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床預(yù)后密切相關(guān)，說明KLKB1可能參與了CRC的發(fā)展過程，對(duì)預(yù)后也有一定的意義。

CEA在許多人類惡性腫瘤中異常表達(dá)，例如胃癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、肺癌和胰腺癌，但在一些非惡性疾病如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、胰腺炎、肝硬化、慢性阻塞性肺疾病、甲狀腺功能減退癥等，其血清水平也可以升高。因此，血清CEA水平升高對(duì)診斷惡性腫瘤或作為早期腫瘤的篩查指標(biāo)并不可靠［15］。MCKEOWN等［5］報(bào)道，CEA診斷CRC的特異度和敏感度分別為36%和87%。湯俊等［16］報(bào)道，CEA診斷CRC中的敏感度為50%～70%，特異度為80%。本研究中CEA診斷CRC的敏感度和特異度分別為75.4%、85.0%，而KLKB1診斷CRC的敏感度和特異度分別為78.5%、95.0%，說明KLKB1診斷CRC的敏感度和特異度均高于CEA。ROC曲線分析顯示，KLKB1診斷CRC的曲線下面積為0.885，高于CEA的0.830，表明KLKB1對(duì)CRC的診斷效能優(yōu)于傳統(tǒng)癌癥指標(biāo)CEA。

綜上所述，CRC患者血漿KLKB1水平升高，且與CRC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，提示其可能參與了CRC的發(fā)展，有望作為診斷CRC、評(píng)估CRC轉(zhuǎn)移及臨床分期的潛在生物標(biāo)志物，為CRC的診療提供新靶點(diǎn)。本研究的不足之處在于：由于樣本量較少，未與良性腸道病變作對(duì)照，因此無法準(zhǔn)確估計(jì)KLKB1的臨界值；僅從臨床血漿樣本中驗(yàn)證了KLKB1可能參與CRC的轉(zhuǎn)移，關(guān)于其如何發(fā)揮生物學(xué)活性作用，有待進(jìn)一步從細(xì)胞學(xué)層面進(jìn)一步證實(shí)。