芍藥八味湯對慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜保護作用的機制研究?

王 浩，方 芳，王杰鵬，劉惠聰，蘇小霞，李 宓，甄曉靜，胡薇薇，方朝義△

(1.河北中醫學院附屬醫院，石家莊 050011； 2.河北省中西醫結合肺病研究重點實驗室，石家莊 050091； 3. 河北中醫學院，石家莊 050200； 4. 石家莊市中醫院，石家莊 050051)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是以胃黏膜上皮遭受反復損害導致胃黏膜腺體萎縮變薄、胃肌層變厚且伴或不伴腸腺化生和(或)假幽門腺化生的一種慢性胃部疾病[1-3]。在我國，CAG發病率居胃病發病之首并呈年輕化趨勢，世界衛生組織更將其列為胃癌發展的癌前狀態[4]。現代醫學尚未完全闡明CAG的發病機制，多認為其系多種因素綜合作用的結果。中醫學采用綜合療法治療CAG取得了顯著的臨床療效[5]。芍藥八味湯是臨床治療胃脘痛的經驗方[6]。前期研究結果顯示，該方藥可改善大鼠胃腸動力和消化機能[7]。本研究擬通過觀察該方藥對CAG大鼠血清及胃組織中增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和促生長素(growth hormone，GH)的影響，進一步揭示其對胃黏膜產生保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級110只健康Wistar大鼠，6周齡，體質量180～220 g，雌雄各半，購自河北醫科大學實驗動物中心，動物合格證號1003122。飼養于標準動物房溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%，光照黑暗各12 h。

1.2 主要藥物

芍藥八味湯組成：白芍30 g，廣木香9 g，砂仁6 g，陳皮10 g，枳殼15 g，厚樸12 g，郁金12 g，炙甘草6 g，購自石家莊樂仁堂藥店。經河北中醫學院中藥藥理學實驗室鑒定為合格藥材，并由該實驗室煎煮濃縮：飲片加水浸泡30 min，先以武火煮至沸騰，后調至文火，每副藥物煎煮2次，將所得煎液混合，分別濃縮為含有生藥量1.042 g/mL(相當于臨床成人用藥量的7倍)、2.084 g/mL(相當于臨床成人用藥量的14倍)的水煎劑，4 ℃冰箱存用。維霉素片(批號20091221，規格0.2 g/片)，鄭州復升藥業有限公司。

1.3 主要試劑

氨水(批號20080714，含氨氣25.0%～28.0%)，沈陽新興試劑廠；脫氧膽酸鈉(批號090511)，美國Sigma公司；PCNA、GH、EGF和VEGF酶聯免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、PCNA、VEGF兔抗大鼠多克隆抗體、鏈霉素-辣根過氧化物酶-生物素(streptaridin-peroxidase，SP)超敏試劑盒及二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)染色液，石家莊勃盛化學試劑有限公司。

1.4 主要儀器

1-15 K型高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；BX60型光學顯微鏡(日本Olympus公司)；CM1900型組織切片機(德國LEICA公司)；HI1210型攤片機(德國LEICA公司)；Max M5型酶標儀(美國Molecular Devices spectra公司)。

1.5 分組、模型制備及給藥

大鼠適應性飼養1周后隨機分為空白對照組(20只)和CAG造模組(90只)，采用復合造模法復制CAG大鼠模型[8]。自造模首日始，每單日自由飲用脫氧膽酸鈉(以蒸餾水配成20 mmol/L的溶液，pH 7.0～7.8)，每雙日自由飲用0.1%氨水，同時配合饑飽失常法(2 d足食，1 d禁食)，連續造模90 d。

90 d后隨機抽取6只造模組大鼠，取胃組織行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)，光鏡觀察胃組織病理形態改變。確認造模成功后，將80只(造模期間4只大鼠死亡，另6只大鼠行HE染色確認模型復制成功)造模大鼠再隨機分為模型組、芍藥八味湯高、低劑量組和維酶素組每組各20只。

模型復制成功后第2天始灌胃每日1次，連續灌胃30 d。空白對照組和模型組灌服生理鹽水(10 mL/kg)，芍藥八味湯高、低劑量組分別灌服高、低濃度芍藥八味湯煎液(10 mL/kg)，維霉素組灌服維霉素混懸液(0.96 g/kg，相當于臨床成人用藥量的14倍)。

1.6 取材

大鼠末次給藥后禁食不禁水24 h。乙醚麻醉后摘取雙側眼球取血3 mL，靜置2 h后離心3500 r/min，15 min，提取血清-20 ℃凍存待檢。繼以頸椎脫臼法處死大鼠取全胃，剪取胃小彎側近幽門部大小約0.3 cm×0.5 cm的組織塊，置于10%甲醛溶液固定；另稱取濕重0.2 g的胃組織置于EP管中，加入1 mL生理鹽水，電動勻漿器勻漿，離心4℃6000 r/min，5 min，提取上清液-20 ℃凍存待檢。

1.7 檢測指標

1.7.1 大鼠一般生物學表征觀察 觀察大鼠活動、精神狀態、毛發光澤度及二便等情況。

1.7.2 HE染色 取固定的胃組織行HE染色，鏡下觀察大鼠胃組織病理形態改變。

1.7.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測PCNA、GH、EGF、VEGF含量 依據試劑盒操作說明書檢測PCNA、GH、EGF、VEGF含量。

1.7.4 免疫組織化學染色觀察胃組織中PCNA、VEGF蛋白表達 免疫組織化學染色(SP法)觀察胃組織中PCNA、VEGF蛋白表達情況。以軟件Image-Pro Plus 6.0測量大鼠胃組織積分光密度(integrated optical density，IOD)和陽性表達面積(area)，計算平均光密度(IOD/area)。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠一般生物學表征觀察結果

空白對照組大鼠被毛貼身緊密，光澤明潤，目珠轉動靈活，活動量大，動作敏捷，大便呈橢圓形顆粒狀，耳色及尾尖淡紅。模型組大鼠逐漸出現精神萎靡，活動緩慢，反應遲鈍，喜扎堆，拱背，便溏，耳及四肢爪甲色淡白，皮毛色澤枯槁易脫落，嚴重者驚動時神情呆鈍，抓取時掙扎少力，大便干稀不調。各治療組用藥后上述表現逐漸好轉，尤以芍藥八味湯高劑量組改善明顯。

2.2 大鼠胃黏膜組織病理形態學觀察

2.2.1 肉眼觀察 空白對照組胃黏膜呈淡紅色，黏膜皺襞表面光滑規整，伸展性好有光澤，表面覆有少量黏液。模型組胃黏膜粗糙，色澤灰暗，可見點狀或片狀出血，表面黏液減少，皺襞低平、稀少甚至消失，走向紊亂。

2.2.2 光學顯微鏡觀察 圖1示，空白對照組大鼠胃黏膜上皮完整，細胞排列整齊且形態規則，呈單層柱狀；固有層內呈現大小形狀較為一致且密集排列的腺體，腺上皮和腺管分界清楚，細胞呈柱狀或圓錐狀，胞漿透明或呈小空泡狀，偶見散在的淋巴細胞，肌層均勻無增生。模型組大鼠胃黏膜上皮細胞萎縮變薄、變性、壞死、脫落，固有層腺體排列紊亂、疏松，腺體和腺細胞數目減少，體積變小，可見淋巴細胞及漿細胞浸潤，部分有淋巴濾泡形成，可見腸上皮化生。治療組炎癥程度均較模型組減輕，胃黏膜炎癥以輕中度為主，未見重度炎癥，尤以芍藥八味湯高劑量組改善明顯。

2.2.3 ELISA檢測大鼠血清中EGF、VEGF、GH含量結果 表1示，與空白對照組比較，模型組大鼠EGF、VEGF含量升高，GH含量下降，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，各用藥組大鼠EGF、VEGF含量下降，GH含量升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與維酶素組比較，芍藥八味湯高劑量組大鼠EGF水平下降，差異有統計學意義(P<0.01)；芍藥八味湯高、低劑量組GH水平均有明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠血清中EGF、VEGF、GH含量比較

2.3 ELISA檢測大鼠胃組織PCNA含量結果

表2示，與空白對照組比較，模型組大鼠PCNA含量升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，各用藥組大鼠PCNA含量下降，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.4 免疫組織化學染色檢測大鼠胃組織PCNA、VEGF蛋白表達結果

圖2、3表2示，與空白對照組比較，模型組PCNA與VEGF表達量明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，用藥組PCNA與VEGF表達均明顯降低(P<0.01)。與維酶素組比較，芍藥八味湯低劑量組PCNA、VEGF平均光密度明顯升高(P<0.01)。

表2 各組大鼠胃組織中PCNA與VEGF水平比較

3 討論

胃黏膜損傷和固有腺體萎縮是CAG典型的病理改變[9]，臨床主要表現為上腹部隱痛、脹滿、噯氣、食欲不振等[10]。該病的發病機制尚未完全明確且缺乏理想藥物。CAG是在多種因素共同作用下的結果，學者多采用更符合疾病臨床特點的多因素綜合造模方法建立動物模型，以探究CAG的發生發展規律[11]。本實驗采用自由飲用脫氧膽酸鈉和氨水，配合饑飽失常法復制CAG大鼠模型，其中自由飲用氨水系模擬幽門螺桿菌感染后高氨狀態對胃黏膜的毒性損害，饑飽失常法是模擬人體飲食不節損傷脾胃。結果顯示，模型組大鼠胃組織萎縮變薄，腺體體積變小，淋巴細胞及漿細胞浸潤，伴見腸上皮化生，證實本實驗采用復合因素造模方式成功復制CAG大鼠模型。

PCNA具有參與細胞調控、DNA損傷修復與甲基化、染色體重塑等重要生物學功能[12]，是反映細胞增殖的重要指標，與DNA復制密切相關。VEGF被認為是參與微血管新生的重要因子。研究證實，CAG患者血清中VEGF水平較正常人群明顯升高，且被認為與胃癌癌前病變密切相關[13]。EGF是一種對多種組織細胞有強烈促分裂作用的生長因子，可刺激胃黏膜上皮細胞生長，同時能通過抑制胃酸分泌、增強胃黏膜黏液的分泌和增加胃黏膜血流量等機制對胃黏膜起到保護作用[14]，其過度表達可引起組織細胞異常增生、代謝增強，被認為是引起癌變的重要因子[15]。GH是一種具有生長調節功能的單肽鏈蛋白質激素，對胃黏膜上皮細胞代謝、生長和分化有直接調節作用。本實驗研究結果表明，CAG大鼠胃組織PCNA含量升高，血清VEGF和EGF含量增加，提示大鼠胃黏膜受到損傷，胃黏膜細胞過度增殖，DNA復制受損；血清GH水平上高，意味著胃黏膜上皮細胞代謝、生長和分化受到損傷。可見，CAG大鼠在實驗過程中存在明顯的胃黏膜受損、修復/損傷機制失調。

結合文獻以及課題組臨床診治CAG經驗，我們認為CAG的發生主要責之于肝氣郁結與素體脾胃虧虛，病位主要在肝和脾胃。肝氣郁結，橫犯脾胃，遂致升降失常；氣機郁滯、血行不暢又致瘀血內停。素體脾胃既虛，運化失司，濕聚難化，內生濕熱。驗方芍藥八味湯重用白芍為君，養血柔肝，緩中止痛。現代藥理研究證實，白芍具有抗炎、鎮痛、保護胃黏膜等作用[16-17]；木香、砂仁、陳皮、枳殼、厚樸行中焦氣滯，散中焦濕蘊，其中木香可抗幽門螺桿菌、促進胃動力和抗胃潰瘍、保護胃黏膜等[18-19]；郁金活血止痛、行氣解郁；炙甘草調和諸藥、和中補虛。諸藥合用契合CAG之病機。本研究結果提示，芍藥八味湯后可下調PCNA、VEGF、EGF表達，上調GH含量，說明芍藥八味湯可調節細胞增殖和生長代謝，抑制微血管再生，促使CAG大鼠胃黏膜修復與損傷之間協調與平衡，從而保護胃黏膜。