天香丹減輕大鼠冠脈微血栓及調節Nrf2/ARE信號通路的機制?

馬學寬，古麗葛娜·薩吾爾，張 華，辛錦鈺，王思靜，安冬青,2△

(1. 新疆醫科大學中醫學院，烏魯木齊 830011； 2. 新疆名醫名方與特色方劑學重點實驗室，烏魯木齊 830011)

冠脈微循環障礙(coronary microcirculation dysfunction，CMD)是急性冠狀動脈綜合征及經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)圍術期常見并發癥。研究顯示，CMD與冠脈無復流或慢血流存在關聯且與患者預后密切相關，在心血管疾病的發生發展及轉歸中起著重要作用[1]。天香丹為臨床運用30余年的名老中醫經驗方，前期研究表明能夠抗自由基損傷，改善缺血再灌注后微循環障礙，減輕心肌缺血[2]。本研究向左心室內注射月桂酸鈉制作大鼠冠脈微循環障礙動物模型，評估天香丹對大鼠冠脈微血栓的影響，檢測核轉錄因子NF-E2 相關因子2 /抗氧化反應元件(nuclear factor erythroid-2-related factor 2 / antioxidant response element，Nrf2/ARE)信號通路相關因子的表達，探究其改善冠脈微循環障礙的機制，為臨床應用提供理論依據。本動物實驗已通過新疆醫科大學第一附屬醫院動物倫理委員會批準(IACUC-20170222027)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠36只，體質量(180±20) g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，實驗動物許可證號SYXK(新) 2018-003，飼養于新疆醫科大學動物實驗中心SPF級環境中。

1.2 藥物

天香丹組成：紅景天、新塔花、丹參、降香等，并由新疆華世丹藥業有限公司制備(批號18091201，每袋9 g，含生藥量3.125 g)；尼可地爾(批號N0837，上海梯希愛公司)。

1.3 試劑及儀器

戊巴比妥鈉(批號P3761)，Sigma公司；月桂酸鈉(批號BCBBV3875)，Sigma公司；蘇木素(批號ZLI-9610)，中杉金橋公司；伊紅(批號ZLI-9613)，中杉金橋公司；馬休黃-酸性品紅-苯胺藍(批號G2040)，索萊寶公司；Nrf2(批號E-AB-33607)，伊萊瑞特公司；Keap1(bs-4648R)、NQO1(bs-23407R)，博奧森公司；正常山羊血清工作液(批號ZLI-9028)、兔SP試劑盒(批號SP-9001)，中杉金橋公司；DAB顯色試劑盒(批號ZLI-9018)；飛利浦HD11XE超聲診斷儀；泰盟HX-300S動物呼吸機，JEM-100CXII型透射電子顯微鏡。

2 方法

2.1 動物建模及分組

SPF級雄性成年SD大鼠27只，體質量180±20 g腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉、備皮、消毒后氣管插管以輔助通氣。開胸暴露心臟及主動脈根部，使用一次性1 mL BD胰島素針刺入左心室(以有回血為準)，迅速注入2 mg/kg月桂酸鈉，同時夾閉主動脈升部與主動脈弓連接處10 s，關胸復蘇、喂養。術中全程無菌操作，術后腹腔注射青霉素3 d預防感染。術后將存活下的手術大鼠隨機分為模型組、尼可地爾組、天香丹組，并設空白對照組大鼠9只。

2.2 給藥劑量

大鼠給藥劑量g/(kg·d)=成人每日劑量(g)×大鼠體表面積/人體表面積[3]，天香丹組大鼠給予 0.9408(X)2/3g/d 天香丹顆粒灌胃。尼可地爾組給予 0.7840(X)2/3mg/d 尼可地爾溶入生理鹽水中灌胃，X代表大鼠體質量kg；空白對照組、模型組給予每日灌胃生理鹽水，每只大鼠給藥體積均為2 mL/d。自大鼠術后第二天開始，每日給藥 1 次，每周按體質量調整給藥量，共給藥28 d。各組大鼠均自由飲水飲食，不限制活動。

2.3 超聲心動圖檢測

給藥28 d后，在全身麻醉的狀態下將其固定后行超聲心動圖檢測。大鼠胸前區備皮，涂以耦合劑，超聲探頭對準胸部第3、4肋間掃描，以M型超聲心動圖連續測量 3 個不同心動周期左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD)并取平均值。按照公式左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)=(左室舒張末期內徑3-左室收縮末期內徑3)/左室舒張末期內徑3×100得到各組大鼠左室射血分數以評價心功能。

2.4 光鏡檢查

超聲心動圖檢測完成后大鼠開胸取出心臟，修剪去除心耳及主要大血管，沿心臟中線切為一半，投入中性甲醛溶液中固定48 h。石蠟包埋后，將組織切成4 μm厚的切片，行HE染色及馬休黃-酸性品紅-苯胺藍染色，觀察微血栓的形成。

2.5 透射電鏡檢查

取大鼠心肌組織，4 ℃下修剪為約1 mm3的組織塊，2.5%戊二醛固定液中固定24 h，經過脫水、滲透、包埋制成切片，染色后透射電鏡下觀察心肌細胞超微結構變化。

2.6 免疫組化檢測

采用免疫組化法檢測心肌組織中核轉錄因子NF-E2 相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)、醌氧化還原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]的表達。一抗稀釋倍數為Nrf 2(1:50)、Keap1(1∶50)、NQO1(1-50)。每組切片中任選1張作為陰性對照，使用 0.01 mol/L PBS代替一抗進行染色。每張切片隨機選取5個視野，以細胞胞漿、胞質、胞核中出現黃色或棕褐色顆粒判斷有陽性反應，采用Image pro plus軟件進行分析。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 心功能檢測

表1示，與空白對照組比較，模型組大鼠LVEDD、LVEF均降低(P<0.05)；與模型組比較，尼可地爾組LVEF升高(P<0.05)，天香丹組LVEDD、LVEF升高(P<0.05)，天香丹組與尼可地爾組LVEDD、LVESD、LVEF比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠心功能比較

3.2 心肌組織病理學變化

圖1示，HE染色結果顯示，空白對照組未發現微血栓，偶爾可見少量紅細胞。模型組大鼠冠脈微血管內分布著由紅細胞、血小板和纖維蛋白構成的紅色或白色血栓混合物，并可見心肌細胞纖維化。與模型組比較，尼可地爾組、天香丹組微血栓程度均有不同程度減輕，心肌排列正常。

圖2示，馬休黃-酸性品紅-苯胺藍染色顯示，冠脈微血管內微血栓的成分多由紅色纖維素和藍色纖維蛋白組成。空白對照組未見微血栓，模型組栓塞程度較重，尼可地爾組及天香丹組微血管內血栓均有不同程度減輕。

注：a.空白對照組；b.模型組；c.模型組心肌細胞；d.尼可地爾組；e.天香丹組；f.天香丹組心肌細胞

3.3 透射電鏡觀察

圖3示，空白對照組透射電鏡圖像可見心肌細胞排列整齊，結構良好。模型組可見心肌細胞閏盤間隙過大，心肌細胞破裂，線粒體絮狀改變，內部復雜性降低，并可看到Z線明顯不平。尼可地爾及天香丹治療后減輕了線粒體損傷，心肌細胞排列較整齊，Z線略平，閏盤正常。

3.4 免疫組化檢測

圖4表2示，與空白對照組比較，模型組Keap1表達升高(P<0.05)；與模型組比較，天香丹組及尼可地爾組Keap1表達均降低(P<0.05)，天香丹組Nrf2、NQO1表達升高(P<0.05)。與尼可地爾組比較，天香組Nrf2、NQO1表達均升高(P<0.05)。

4 討論

冠脈微循環障礙是指在多種因素的作用下，冠狀前小動脈和小動脈結構與(或)功能異常所致勞力性心絞痛或心肌缺血的臨床綜合征[4]。研究發現，冠脈微循環障礙可表現為冠脈無復流、慢復流、X綜合征、缺血再灌注損傷等[5-6]。月桂酸鈉具有強烈的內皮損傷作用，可造成血管內皮的脫落甚至穿孔。本研究使用月桂酸鈉作為內皮損傷劑行左心室內注射制作冠脈微循環障礙動物模型，更貼近臨床病理生理實際情況[7]。

注：a.空白對照組；b.模型組；c.模型組心肌細胞；d.尼可地爾組；e.天香丹組；f.天香丹組心肌細胞

注：En.血管內皮(vascular endothelial)；Er.紅細胞(red blood cell)；M.線粒體(mitochondrion)；Id.閏盤(intercalated disc)注：a.空白對照組；b.模型組；c.模型組閏盤；d.尼可地爾組；e.天香丹組；f.天香丹組閏盤

注：a.空白對照組；b.模型組；c.尼可地爾組；d.天香丹組

表2 各組大鼠心肌免疫組化染色中IOD值比較

心臟超聲心動圖檢測LVEF值能夠準確反映大鼠的心臟功能，在不使用侵入性方式或放射性示蹤劑的情況下，超聲心動圖是非侵入性冠狀動脈血流評估的替代方案之一[8-9]。本研究發現，模型組大鼠LVEF降低，尼可地爾組及天香丹組大鼠心功能恢復正常。結合文獻及本研究結果，其可能的原因為冠脈微血管內出現微血栓，伴隨心肌發生纖維化，心肌細胞缺血缺氧導致心功能降低。尼可地爾及天香丹能夠改善心肌缺血，從而提高心功能[10-11]。

研究表明，Nrf2及其下游NQO1的表達上調是激活Nrf2/ARE信號通路的標志[12-14]。當發生過氧化時Nrf2與Keap1解偶聯，解離的Nrf2進入胞核，激活Nrf2/ARE信號通路，調控下游抗氧化元件NQO1。NQO1能夠還原醌類及其衍生物，阻止其產生活性氧并降低其毒性，從而減輕氧化應激反應[15-16]。中西藥都可通過Nrf2/ARE信號通路發揮改善微循環障礙的作用。如齊欣[17]研究發現，益氣活血藥能通過激活Nrf2/ARE通路表達，并達到改善冠脈微循環障礙的作用。白雪思等[18]發現，川芎嗪聯合卡波金通過上調Nrf2的磷酸化程度、下調Keap1的表達而發揮抗氧化作用，改善微循環障礙。本研究中，與模型組比較天香丹組Nrf2及其下游NQO1的表達增強，從而證實天香丹激活Nrf2/ARE信號通路。

冠脈微循環障礙屬于中醫學“胸痹”“真心痛”等范疇。研究發現，川芎嗪、麝香保心丸等中藥提取物或中成藥均能改善微循環，提高組織灌注水平[19-23]。天香丹為“通補開泄法”治療冠心病的代表方。前期研究表明，可改善冠心病患者的胸悶、胸痛、心悸等癥狀[24]。本研究顯示，冠脈微循環障礙發生時，微血管內出現微血栓，心肌超微結構發生改變。天香丹能夠減輕月桂酸鈉誘導的冠脈微血管內血栓程度，上調Nrf2、NQO1的表達，對Nrf2的負調控因子Keap1產生抑制作用。這可能與激活Nrf2/ARE信號通路有關。

本研究闡釋了天香丹改善冠脈微血栓、提高心功能的機制，為天香丹防治冠脈微循環障礙提供理論依據。本研究還需進一步從天香丹是否調控Nrf2/ARE信號通路下游因子的表達，減輕氧化應激反應，而改善冠脈微循環障礙進行探討。