疏肝調神針法對偏頭痛模型大鼠血管活性物質和腺苷A1受體表達的影響?

黃紹磊，王蘇瑤，王萌萌，韓 晶,3△，楊佃會,3△

(1. 山東中醫藥大學針灸推拿學院，濟南 250014； 2. 濟南市歷下區人民醫院，濟南 250014； 3. 山東中醫藥大學附屬醫院，濟南 250011)

偏頭痛是一種常見的慢性、反復發作的神經系統疾病，以單側或雙側發作性、持續性、搏動性頭痛為主要臨床表現，給患者造成了嚴重的身心傷害，同時加劇了社會經濟負擔[1-4]。偏頭痛的病因尚未完全明確，可能與血管、神經、內分泌、免疫及遺傳等因素有關[5-8]。現代醫學尚未有理想的治療方法，多以非甾體抗炎類、曲普坦類、鈣通道拮抗劑等藥物治療以緩解癥狀和預防發作，但用藥周期長、藥物依賴性嚴重且伴有一定的副作用[9-10]。針刺治療偏頭痛的療效確切[11]。疏肝調神針法是全國名老中醫單秋華教授用于治療疼痛類疾病的臨證經驗，療效顯著[12-13]。本研究通過觀察疏肝調神針法對偏頭痛大鼠行為學、外周血中血管活性物質5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、P物質(substance P，SP)及三叉神經脊束核中腺苷A1受體(adenosine A1 receptor，ADORA1)基因和蛋白表達的影響，探討其可能的作用機制，為臨床治療提供科學依據。本研究已通過山東中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級健康Wistar雄性大鼠32只，體質量(200～240) g，購自濟南彭悅公司，生產許可證號scxk魯20140007。于山東中醫藥大學附屬醫院SPF級實驗中心飼養操作，控制溫度為20～25 ℃，濕度50%～60%，自由飲水飲食。

1.2 主要試劑及儀器

硝酸甘油注射液(1 ml:5mg，北京益民藥業有限公司)；Rat 5HT ELISA Kit(CSB-E08364 r)、Rat CGRP ELISA Kit(CSB-E08211 r)、Rat SP ELISA Kit(CSB-E08358 r),武漢華美生物工程有限公司)；ADORA1 Antibody(ab82477,美國abcam公司)；華佗牌針灸針(φ0.3×15 mm，蘇州醫療用品廠有限公司)。

PCR儀(IT041-0002，上海依科賽生物制品有限公司)；微量分光光度計(MINIDROP，上海依科賽生物制品有限公司)；超純水儀(1.5 LPM，美國Millipor synergy)；離心機(techcomp CT15RT，北京格瑞恩科技發展公司)；病理切片機(RM2016型，上海徠卡儀器有限公司)；石蠟包埋機(JB-P5型，武漢俊杰電子有限公司)。

2 方法

2.1 分組

適應性喂養1周后，將32只Wistar大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組、普通針刺組、疏肝調神組每組各8只。

2.2 干預方法

各組大鼠每天抓取固定30 min，同時根據全國普通高等教育中醫藥類精編教材《實驗針灸學》[14]確定大鼠穴位并進行針刺。疏肝調神組：選取風池(雙)、百會、太沖(雙)、內關(雙)，穿透大鼠皮膚約1～2 mm，百會、風池斜刺；內關、太沖直刺，留針30 min。普通針刺組：參照全國普通高等教育中醫藥類精編教材《針灸治療學》[15]頭痛病癥，選取百會、風池(雙)，操作同上，連續7 d，第8天造模。

2.3 造模

對照組于大鼠頸后皮下注射0.9%氯化鈉注射液0.5 mg。其余各組均參照經典硝酸甘油造模法[16]，于大鼠頸后皮下注射硝酸甘油注射劑(5 mg/kg)，制備實驗性偏頭痛大鼠模型。造模成功標準：造模10～20 min后給藥大鼠出現前肢頻繁撓頭、雙耳發紅、咬尾、爬籠次數增多、往返運動增多等[17]。

2.4 觀察指標及檢測方法

2.4.1 行為學評分 記錄各組大鼠撓頭、咬尾、爬籠、往返運動的次數，每個癥狀1次記1分，進行行為學評分[13]。大鼠造模前0～30 min第1次評分，30～60 min造模，60～90 min第2次評分，90～120 min抓取固定或針刺，120～150 min第3次評分。

2.4.2 血清5HT、CGRP、SP含量 行為學評分結束后將大鼠稱重，用10%水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉，取腹腔靜脈血5 mL，放入離心機中4℃4000 r/min離心5 min后取血清，使用ELISA試劑盒檢測5HT、CGRP、SP濃度，嚴格按照說明書進行實驗操作。

2.4.3 ADORA1的mRMA表達 熒光定量PCR法檢測三叉神經脊束核中ADORA1的mRMA表達：將大鼠行急性斷頭取腦術，切取部分三叉神經脊束核，加液氮充分研磨，加入1 ml TRIpure LS Reagent，充分吹打混勻。提取RNA，以吸光度法測RNA濃度及純度。用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，cDNA模板2 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，2 mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。引物序列：ADORA1：上游5′-CTCTCCGGTACAAGACAGTGGTG-3′；ADORA1：下游5′-CACACTTGATCACGGGCTCC-3′；GAPDH：上游5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′；GAPDH：下游5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。PCR儀中95 ℃預變性10 min，95 ℃變性20 s， 56 ℃退火30 s，72℃20 s延伸，40個循環。以GAPDH為內參，2-△△Ct計算各組mRNA相對表達量。

2.4.4 ADORA1蛋白表達 免疫組化法檢測三叉神經脊束核中ADORA1蛋白表達：取部分三叉神經脊束核置4%多聚甲醛液4 ℃冰箱中固定后，經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烘干等步驟制備石蠟切片。切片常規脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育5～10 min，熱修復抗原，冷卻后PBS洗片1～2次, 加5%正常山羊血清封閉液室溫20 min，加入1∶1000稀釋的ADORA1抗體4°C過夜，PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，加辣根酶標記，DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染、脫水、透明、封片，400倍顯微鏡下觀察，每張切片選取3個視野，計算陽性細胞累積光密度值。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠行為學比較

表1示，造模前第1次評分各組大鼠行為學比較無差異。造模后第2次評分模型組行為學均較對照組明顯升高(P<0.05)，疏肝調神組、普通針刺組評分明顯低于模型組(P<0.05)；疏肝調神組與普通針刺組評分比較略低，差異無統計學意義(P>0.05)。第3次評分疏肝調神組、普通針刺組明顯低于模型組(P<0.05)，而疏肝調神組評分略低于普通針刺組，差異無統計學意義(P>0.05)。疏肝調神組、普通針刺組第3次評分均較第2次評分有明顯降低(P<0.05)。

表1 大鼠行為學評分比較

3.2 各組大鼠血管活性物質含量比較

圖1示，與對照組比較，模型組血清5-HT含量明顯降低，SP、CGRP含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，疏肝調神組和普通針刺組5-HT含量明顯升高，SP、CGRP含量明顯降低(P<0.05)；與普通針刺組比較，疏肝調神組大鼠血中5-HT、SP、CGRP含量均有明顯改變(P<0.05)。

注：與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與普通針刺組比較：▲P<0.05

3.3 各組大鼠三叉神經脊束核中ADORA1的mRNA表達比較

圖2示，與對照組比較，模型組大鼠三叉神經脊束核中ADORA1的mRNA表達明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，疏肝調神組、普通針刺組大鼠三叉神經脊束核中ADORA1的mRNA表達均明顯升高(P<0.05)；與普通針刺組比較，疏肝調神組大鼠三叉神經脊束核中ADORA1的mRNA表達明顯升高(P<0.05)。

注：與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與普通針刺組比較：▲P<0.05

3.4 各組大鼠三叉神經脊束核中ADORA1免疫組化陽性表達比較

圖3、4示，與對照組比較，模型組大鼠三叉神經脊束核中ADORA1免疫組化陽性細胞累積光密度明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，疏肝調神組、普通針刺組大鼠三叉神經脊束核中ADORA1免疫組化陽性細胞累積光密度均明顯升高(P<0.05)；與普通針刺組比較，疏肝調神組大鼠三叉神經脊束核中ADORA1免疫組化陽性細胞累積光密度明顯升高(P<0.05)。

注：與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與普通針刺組比較：▲P<0.05

圖4 三叉神經脊束核中ADORA1免疫組化陽性細胞(×400)

4 討論

疏肝調神針法是全國名老中醫單秋華教授的重要學術經驗，用于治療偏頭痛臨床療效顯著，現已被廣泛應用于各種痛證的治療。本法重視疏肝與調神，治療偏頭痛時在基礎選穴上加太沖以疏肝，百會、內關以調神。太沖為肝經原穴，可疏肝理氣，氣機暢則頭痛止；百會為調神要穴，可開竅醒神以止頭痛；內關為心包經絡穴，可寬胸理氣、調心醒神以治頭痛，諸穴相配增強止痛之效。

三叉神經血管學說是目前偏頭痛的主流學說，以硝酸甘油造?？奢^好地維持痛覺過敏的狀態，誘導神經源性炎性反應，模擬三叉神經血管炎性學說[17]。本研究造模后大鼠行為學第2次評分疏肝調神組、普通針刺組均明顯低于模型組，說明針刺對偏頭痛的發作具有一定的預防作用；第3次評分疏肝調神組、普通針刺組明顯低于模型組，且明顯低于第2次評分，說明針刺對偏頭痛的即時鎮痛作用顯著；且此2次評分疏肝調神組均略低于普通針刺組，差異無統計學意義。猜測其可能由于觀察時間較短及樣本量限制，從行為學觀察疏肝調神針法較普通針刺優勢尚不明顯[13]。

5-HT是經典的鎮痛物質，大量的實驗揭示了5-HT在痛覺調制過程中的作用。5-HT作為神經系統中重要的神經遞質，在人體中樞神經系統及外周組織中廣泛分布。在偏頭痛發作時，5-HT從血小板中釋放出來，血漿內5-HT含量出現一過性升高，隨后其附著于血管壁上，隨即血漿內5-HT含量逐漸降低，引起顱內血管出現反跳性舒張，進而導致患者出現搏動樣頭痛[18-19]。CGRP是一種具有神經細胞保護作用和強大舒血管作用的調節肽，其廣泛存在于中樞和外周神經系統中，其在外周參與傷害性信號的傳遞及痛覺敏化的形成[20]。研究發現，偏頭痛發生時血漿CGRP水平的升高與疼痛程度和持續時間呈正相關[21]。SP屬速激肽家族中的一種，通過受體與多種第二信使系統偶聯，發揮神經遞質與調質的作用，參與痛覺調制、感覺信息傳遞、神經內分泌及心血管活動等復雜的生理功能[22]。SP可與其受體結合引起神經細胞興奮、敏感性升高，誘發神經內分泌和免疫作用，刺激中樞的炎性因子的分泌，血管通透性升高，血管擴張而引起神經炎性痛，導致偏頭痛的發作。臨床研究發現，偏頭痛患者血漿中SP含量明顯高于普通人[23]。本研究中以硝酸甘油造模后，模型組較對照組血中5-HT含量明顯降低，CGRP、SP的含量明顯升高，提示5-HT、CGRP、SP均參與偏頭痛的發生。針刺后，疏肝調神組、普通針刺組血中5-HT含量明顯高于模型組，CGRP、SP含量明顯低于模型組，且疏肝調神組較普通針刺組變化更明顯，提示針刺治療偏頭痛的機制與調節5-HT、CGRP、SP含量有關，且疏肝調神針法對其調節作用更顯著，通過5-HT、CGRP、SP共同參與調節血管的收縮與舒張，達到鎮痛效果。

腺苷是一種重要的神經遞質和調質，其通過與特異的受體結合，參與體內多個系統疾病的病理生理過程。研究證實，腺苷對炎性疼痛及神經性疼痛均有效，主要通過ADORA1實現。ADORA1廣泛分布于人體各個系統，但在神經系統中分布最多?，F有研究表明，ADORA1可通過多種信號傳導通路產生鎮痛作用。ADORA1是一種重要的內源性信號傳導分子，在各種傷害性刺激發生時，其通過激活G蛋白偶聯受體調節細胞內陽離子的跨膜流動，進而影響神經元的興奮性與遞質的釋放，發揮鎮痛、抗炎等作用。研究表明，側腦室注射ADORA1激動劑對硝酸甘油偏頭痛模型大鼠具有明顯鎮痛作用[24-25]。本研究中造模后三叉神經脊束核中ADORA1的mRNA及免疫組化陽性表達均明顯降低，針刺后均明顯升高，且疏肝調神組較普通針刺組變化更明顯，表明針刺對偏頭痛的治療作用與調節三叉神經脊束核中ADORA1的含量有關，且疏肝調神針法對其調節作用更顯著，其鎮痛機制可能是ADORA1與腺苷結合，在突觸前后發揮抑制作用，減少傷害性刺激在中樞的傳導，影響神經遞質及血管活性物質的釋放，從而抑制三叉神經系統激活，減少神經源性炎癥反應及中樞敏化的產生。綜上，疏肝調神針法對偏頭痛有良好的防治作用，作用機制可能是通過三叉神經血管系統，調節三叉神經脊束核中ADORA1及血中5-HT、CGRP、SP含量，發揮鎮痛作用，且相較于普通針刺作用更明顯。未來將做進一步研究，深入探討針刺鎮痛的機制。