溫和灸對大鼠肌筋膜激痛點肌衛(wèi)星細(xì)胞激活及成肌修復(fù)的影響?

林業(yè)武，曹 磊，陳美雄，高彥平，袁仕國△

(1. 海南省中醫(yī)院骨傷科, 海口 570203； 2. 海南省中醫(yī)院麻醉科, ?？?570203； 3. 南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院廣東省骨科研究院, 廣州 510630)

肌筋膜疼痛綜合征通常由急性和慢性骨骼肌損傷引起，超過3/4的世界人口都受其影響，是最重要和常被忽視導(dǎo)致運(yùn)動功能障礙的原因[1]。肌筋膜激痛點(myofascial trigger point, MTrP)是骨骼肌中緊張的帶狀組織中的過敏結(jié)節(jié)，是診斷和治療肌筋膜疼痛綜合征的關(guān)鍵點[2]。骨骼肌在各種原因形成MTrP后，由于持續(xù)疼痛使功能障礙、廢用性萎縮，最終導(dǎo)致肌細(xì)胞萎縮、肌束纖維化，形成不可逆性病理改變。當(dāng)肌肉出現(xiàn)嚴(yán)重纖維化時即表現(xiàn)為觸診中出現(xiàn)的條索和結(jié)節(jié)甚至發(fā)生鈣化。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(skeletal muscle satellite cell, SMSC)又名成肌干細(xì)胞或骨骼肌干細(xì)胞，是骨骼肌損傷后修復(fù)的關(guān)鍵干細(xì)胞[3]。SMSC是骨骼肌組織內(nèi)在的修復(fù)與維護(hù)系統(tǒng)，它通常是靜止的，但在肌肉損傷或劇烈運(yùn)動后開始激活并增殖，可進(jìn)入分化程序，與受損的肌纖維融合或形成新肌纖維，或重新恢復(fù)靜止的SMSC數(shù)量，或者分化為成纖維細(xì)胞等[4]。配對盒轉(zhuǎn)錄因子7(paired box gene 7, Pax7)是SMSC的標(biāo)記性基因，對其活化、增殖、分化等均有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，靜止的SMSC為Pax7陽性，而激活后開始逐漸喪失，成肌分化后則消失[5]。Pax7陽性是保持SMSC自我復(fù)制的關(guān)鍵標(biāo)志[6]。艾灸作為中醫(yī)的傳統(tǒng)瑰寶，在治療疼痛性疾病中發(fā)揮了巨大作用，并以其簡便驗廉優(yōu)勢在各個科室大量使用[7]，而溫和灸是艾灸中最常用的方式。但艾灸治療肌筋膜疼痛綜合征作用機(jī)制缺乏研究。艾灸MTrP可促進(jìn)局部炎癥因子消退和成肌修復(fù)[8-9]，但對SMSC增殖分化等影響尚不清楚。故本項目擬探索溫和灸對MTrP修復(fù)過程中成肌修復(fù)和SMSC的影響，旨在為溫和灸治療肌筋膜疼痛綜合征提供深入的理論支持。本研究已通過南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審查，動物飼養(yǎng)和操作等符合科學(xué)和動物倫理規(guī)范，同時接受南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會監(jiān)督。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠30只，8周齡體質(zhì)量(285.5±18.3)g，購自南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實驗中心，實驗動物許可證號SCXK(粵)20160041。溫和灸純艾絨艾條，北京同仁堂(亳州)飲片有限責(zé)任公司；XR-PT-10 A型動物實驗跑臺，上海欣軟信息科技有限公司。根據(jù)文獻(xiàn)自制打擊器，主要部分為長度50 cm的木棒，木棒頂端加有重物，木棒及重物總質(zhì)量1200 g，下端為鈍頭錐形，打擊面積1 cm×1 cm，打擊高度20 cm，動能2.352 J；BX-53型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；Pax7抗體(Polyclonal,AF7584)由Affinity Bioscience公司、二抗(keyFluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)，KGAB010)由keyGEN bioTECH提供。

1.2 大鼠分組

30只SD大鼠均分入正常組、模型組和溫和灸組每組各10只。正常組不予任何干預(yù)，為空白對照組；模型組僅行MTrP造模；溫和灸組行MTrP造模+溫和灸干預(yù)。

1.3 大鼠干預(yù)

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d然后開始造模干預(yù)。正常組常規(guī)飼養(yǎng)不予干預(yù)，模型組采用打擊結(jié)合離心運(yùn)動的方法建立MTrP模型。造模方法：用 10%的水合氯醛按3 ml/kg行腹腔麻醉，固定大鼠后在大鼠右股內(nèi)側(cè)肌中段偏近側(cè)端做一打擊位置標(biāo)記，自制打擊器的錐形鈍頭從20 cm高處落下，造成打擊部位的骨骼肌損傷；第2天大鼠于傾角為-16°的電動跑臺上進(jìn)行持續(xù)性下坡跑訓(xùn)練，速度16 m/s，持續(xù)90 min，運(yùn)動中使用聲音和機(jī)械刺激驅(qū)趕，每周進(jìn)行打擊和跑臺運(yùn)動1次，連續(xù)4周，然后第31～60天正常飼養(yǎng)不予干預(yù)(具體方法參見文獻(xiàn)[8, 10])。溫和灸組進(jìn)行MTrP造模+艾灸干預(yù)。MTrP造模同模型組，然后每次打擊后第3天至第7天進(jìn)行MTrP(打擊部位)溫和灸。操作如下：麻醉后固定，用定制的動物用細(xì)艾條(長20 cm,直徑7 mm)點燃后，正對大鼠打擊部位進(jìn)行艾灸刺激30 min，將溫度控制儀探頭置于施灸穴位皮膚表面以監(jiān)測實時溫度，通過調(diào)節(jié)艾條與施灸穴位的距離在4～5 cm左右[11]，將施灸局部皮膚溫度控制在(46 ℃±1℃)。MTrP打擊后第3～7天溫和灸，每日1次，連續(xù)5 d為1個療程，共4個療程。

1.4 MTrP取材及組織病理片制作

所有組別在第30天和第60天分別隨機(jī)取5只大鼠，然后10%的水合氯醛按6 ml/kg用量腹腔注射過量麻醉處死大鼠。按文獻(xiàn)方法取材，暴露股四頭肌，用拇指和食指指腹輕輕按壓探尋股四頭肌，查找股內(nèi)側(cè)肌打擊部位及周圍的肌緊張帶，可觸摸及明顯的緊張帶和/或膨大的結(jié)節(jié)，并予以針灸針刺入此處，引出顫搐反應(yīng)者即為MTrP[8]。正常組則在右側(cè)股內(nèi)側(cè)肌相應(yīng)的位置取材。標(biāo)本以MTrP為中心，切取1 cm×1 cm×1 cm軟組織塊，用生理鹽水漂洗2～3次，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚切片，脫蠟至水，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察MTrP炎癥細(xì)胞浸潤、肌細(xì)胞扭曲、斷裂、壞死、收縮結(jié)節(jié)、纖維化修復(fù)等病理形態(tài)。每個標(biāo)本隨機(jī)取5個切片，每個切片采集5個200倍視野圖片，使用Image J軟件分析肌細(xì)胞所占面積，最終取其均數(shù)。

1.5 MTrP組織中Pax7檢測

采用免疫熒光法檢測Pax7。上述石蠟切片脫蠟至水后采用0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 7.4) 60 ℃熱抗原修復(fù)16 h，自然冷卻至室溫下。山羊血清37 ℃封閉15 min，滴加稀釋比為1∶100兔抗大鼠Pax7一抗，4 ℃孵育16 h，PBS洗后滴加稀釋比1∶200的keyFluor 488標(biāo)記山羊抗兔二抗，4 ℃孵育1 h，其余常規(guī)操作。熒光顯微鏡下觀測Pax7熒光強(qiáng)度，每個標(biāo)本隨機(jī)取5個切片，每個切片采集5個200倍視野圖片，采用Image J分析Pax7熒光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有大鼠無死亡，模型組、溫和灸組大鼠無骨折、皮膚破潰、感染等。模型組2只、溫和灸組1只大鼠血腫稍重，自行緩解，不影響后續(xù)實驗。正常組較模型組、溫和灸組大鼠活躍多動，各組飲食正常。

2.2 骨骼肌組織病理形態(tài)變化

光鏡下觀察可見，正常組骨骼肌肌細(xì)胞第30天和第60天均呈規(guī)則的多邊形且排列正常，無壞死扭曲，間隙均衡，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(見圖1a、1b)。模型組在第30天可見肌細(xì)胞扭曲、萎縮、斷裂，呈類圓形和不規(guī)則形，可見收縮結(jié)節(jié)，大量炎癥細(xì)胞浸潤；第60天少量炎癥細(xì)胞浸潤，但肌細(xì)胞仍呈類圓形或不規(guī)則形且萎縮、扭曲，收縮結(jié)節(jié)明顯(見圖1c、1 d)。溫和灸組在第30天可見肌細(xì)胞扭曲、萎縮，細(xì)胞間隙增大，炎癥細(xì)胞浸潤，但均較模型組改善；第60天炎癥細(xì)胞浸潤已消失，肌細(xì)胞萎縮、扭曲明顯改善，呈大小不等的多邊形，少量收縮結(jié)節(jié)，肌細(xì)胞再生(見圖1e、1f)。

圖1 不同時間組別的骨骼肌HE染色

2.3 各組骨骼肌細(xì)胞面積比例

表1示，正常組在第30天和第60天骨骼肌細(xì)胞橫截面積占視野面積比例(百分比)顯著，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型組第30天和第60天比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，即MTrP造模后肌細(xì)胞會持續(xù)萎縮。溫和灸組第60天骨骼肌細(xì)胞橫截面積較第30天大且差異顯著(P<0.05)，即溫和灸后MTrP局部肌細(xì)胞面積明顯增長，且存在長期效果。同時在第30天時正常組肌細(xì)胞百分比最大，模型組最小，溫和灸組處于中間，即溫和灸可有效預(yù)防MTrP 的肌細(xì)胞萎縮；第60天時仍是正常組肌細(xì)胞百分比最大，模型組最小，溫和灸組雖然肌細(xì)胞大部分恢復(fù)，但尚未達(dá)到正常。

表1 不同組別大鼠肌細(xì)胞橫截面積占視野面積的百分比

2.4 Pax7的免疫熒光檢測

圖2表2示，正常組在第30天和第60天的Pax7免疫熒光強(qiáng)度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組在第30天和第60天Pax7比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，即MTrP造模后Pax7持續(xù)低表達(dá)，第60天時SMSC的Pax7表達(dá)微弱。溫和灸組第30天和第60天比較差異顯著(P<0.05)，即溫和灸干預(yù)可使MTrP局部SMSC避免過度激活，保持適度的增殖，并補(bǔ)充消耗的SMSC 。

表2 各組Pax7熒光強(qiáng)度數(shù)值及比較

3 討論

肌筋膜疼痛綜合征廣泛見于全身多處，如咬肌、三角肌、斜方肌、背闊肌、骶棘肌、臀中肌等[12]，至少85%的人都會經(jīng)歷肌筋膜疼痛。各個?？崎T診觀測到發(fā)病率差異較大，普通骨科門診為21 %，特殊疼痛中心可高達(dá)93 %[13]，而老年久坐的女性發(fā)病率最高[14]，由此導(dǎo)致的疼痛、功能障礙以及心理負(fù)擔(dān)均極為普遍。但是對肌筋膜疼痛綜合征的基礎(chǔ)研究卻較為缺乏，近年來鮮有進(jìn)展，故對其病理機(jī)制與治療需要深入研究。

MTrP是肌筋膜疼痛綜合征的關(guān)鍵特征，目前的基礎(chǔ)研究及臨床診治主要以MTrP為出發(fā)點。但MTrP的精確機(jī)制仍不明確，盡管現(xiàn)在很多理論揭示外周傷害感受器和中樞敏化等是可能的原因之一[15]。乙酰膽堿增加并在運(yùn)動終板釋放，這個在活動的MTrP上可以用肌電圖記錄到，但不能作為診斷的標(biāo)準(zhǔn)。增加的乙酰膽堿可導(dǎo)致局部持續(xù)的肌節(jié)縮短，產(chǎn)生收縮結(jié)節(jié)。該收縮結(jié)節(jié)隨后引起血管收縮和肌肉的相對缺血。血管活性物質(zhì)和促炎物質(zhì)，如前列腺素、緩激肽、血清素和組胺響應(yīng)這種局部缺血而釋放，并使肌肉產(chǎn)生敏感性疼痛。這些物質(zhì)還可以激活局部自主反應(yīng)釋放更多乙酰膽堿，產(chǎn)生正反饋回路，形成惡性循環(huán)。導(dǎo)致MTrP相關(guān)異常性疼痛、血流改變、出汗異常、反應(yīng)性充血以及豎毛反應(yīng)等[14, 16]。MTrP局部存在炎癥因子的高表達(dá)[9, 17]，而炎癥對骨骼肌干細(xì)胞-SMSC存在較復(fù)雜的影響，能直接激活并促進(jìn)SMSC分化[18]。持續(xù)的炎癥可導(dǎo)致惡性循環(huán)，誘發(fā)炎癥瀑布效應(yīng)，最終導(dǎo)致SMSC局部的微環(huán)境/龕發(fā)生變化，SMSC可能無法保持自我復(fù)制，可能導(dǎo)致其過度激活并耗竭[19-20]。SMSC耗竭后損傷的肌細(xì)胞壞死、萎縮而得不到補(bǔ)償，同時在炎癥因子等作用下，肌束逐漸纖維化，收縮功能減弱或消失，同時導(dǎo)致局部疼痛，由此引發(fā)臨床癥狀和功能障礙。

由于肌筋膜疼痛綜合征發(fā)病機(jī)制缺乏研究，其治療尚未有突破。溫和灸作為中醫(yī)艾灸的代表，在治療運(yùn)動系統(tǒng)等疼痛性疾病中廣泛應(yīng)用[21]。但艾灸作用機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)代研究認(rèn)為是熱、光、煙等刺激，多靶點、多途徑激發(fā)了機(jī)體自身的內(nèi)源性調(diào)節(jié)系統(tǒng)，產(chǎn)生了內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮靶器官調(diào)節(jié)效應(yīng)。MTrP局部存在炎癥狀態(tài)[17]，艾灸不僅可降低MTrP局部的炎癥因子，亦促進(jìn)成肌修復(fù)[8-9]，也可降低如神經(jīng)根等炎癥[22]。肌筋膜疼痛綜合征屬于中醫(yī)傷證范疇，氣滯血瘀為主要病機(jī)，而溫和灸具有良好的行氣活血、通絡(luò)止痛等作用，非常適合肌筋膜疼痛綜合征的治療。本實驗造模后HE染色顯示，造模理想，在大鼠上成功復(fù)制MTrP。實驗中為方便而有效的實施溫和灸，采用損傷局部即MTrP溫和灸治療。發(fā)現(xiàn)溫和灸后MTrP炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕，這可與以往研究相互印證。且溫和灸存在后繼療效，能明顯增加肌細(xì)胞面積，促進(jìn)成肌修復(fù)。SMSC受到各種原因激活后開始增殖或分化，而增殖后的SMSC重新恢復(fù)靜止?fàn)顟B(tài)，補(bǔ)充SMSC從而保持SMSC的干細(xì)胞干性，出現(xiàn)Pax7陽性表達(dá)[5]。造模組SMSC的Pax7表達(dá)量微弱，表示SMSC大量激活，然而在造模后1個月(第60天)Pax7表達(dá)量更微弱，意味著SMSC數(shù)量極少且已被過度消耗，趨于耗竭。HE染色發(fā)現(xiàn)，造模組在第30天和第60天時MTrP局部的肌細(xì)胞數(shù)量少且面積占比低，與Pax7的表達(dá)一致。研究發(fā)現(xiàn)，局部微環(huán)境對于SMSC保持干性和數(shù)量至關(guān)重要[3]，炎癥狀態(tài)下SMSC激活，且多分化成為成纖維細(xì)胞等，“炎癥瀑布”則導(dǎo)致SMSC無法實現(xiàn)增殖，最終趨于耗竭[23-24]。SMSC趨于耗竭后骨骼肌損傷將難以成肌修復(fù)，導(dǎo)致萎縮、纖維化并產(chǎn)生功能障礙等。本研究通過Pax7的檢測發(fā)現(xiàn)，溫和灸后可使MTrP局部的SMSC保持適度的自我復(fù)制，抑制其過度的激活，避免SMSC的過度消耗。這種效果在溫和灸停止后30 d仍存在，說明溫和灸具有良好的調(diào)控SMSC增殖、分化的作用。但溫和灸的進(jìn)一步量效關(guān)系、具體信號機(jī)制等仍需要深入研究。

總之，本研究進(jìn)行肌筋膜疼痛綜合征的大鼠模型造模，成功復(fù)制MTrP大鼠模型，并予以溫和灸干預(yù)MTrP組，發(fā)現(xiàn)溫和灸可促進(jìn)MTrP局部的炎癥消退，抑制SMSC的過度激活，保護(hù)SMSC的適當(dāng)自我復(fù)制，促進(jìn)骨骼肌修復(fù)。