不同刮痧力度對大鼠皮膚形態及5-羥色胺、肥大細胞表達變化的比較研究?

楊昆吾，楊金生，徐東升，王瑩瑩△，劉 惠，陳淑敏，吉 佳

(1. 陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046； 2.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700；3.中國中醫科學院針灸研究所，北京 100700)

刮痧是指在中醫經絡腧穴理論指導下，使用不同材質與形狀的刮痧器具，在體表進行相應的手法刮拭，以防治疾病的中醫外治法[1]。中醫學認為，刮痧是通過刺激穴位、皮膚經絡，將體內邪氣驅逐出體表，從而達到活血通絡、增強臟腑功能的作用[2]，不僅在臨床上應用廣泛，而且在養生保健方面也發揮著重要作用[3-5]。通過現代研究發現，運用刮痧板刺激穴區可使其刺激部位的微細血管擴大或破裂， 從而使皮膚產生形態變化形成“痧象”，作為一種刺激源激活并持續發揮生物學效應[6]。有學者[7]觀察到，刮痧可以增加人體刮拭區域局部皮膚微循環，以達到緩解疼痛的作用。Spohn D等[8]認為，刮痧作用的產生是通過對局部皮膚的刺激，使皮膚和血管感受器產生反射，隨后傳導至中樞神經系統，對其興奮和抑制過程起到平衡作用，強化對機體的調節和控制。我們前期的臨床研究表明，循經和“出痧”是影響臨床療效的重要因素[9]。然而目前對于刮痧機制的研究、對于刮痧力度都沒有一個準確的說明。現有的國家標準在刮痧力度方面，也缺少明確的量化標準，導致臨床只能根據醫生自己的經驗和習慣對患者進行刮痧，這使得刮痧在臨床規范應用與理論研究方面的發展受到制約，也影響了國際上對于刮痧的認可程度和傳播[10]。

本研究認為刮痧力度的大小，是決定刮痧治療效果的主要因素之一，在確保刮痧的次數、時間、頻率等相對一致的情況下，運用自行研制的刮痧力度檢測儀，探索不同力度(強度)對刮痧效果的影響具有實際意義。本研究的實驗方案已通過中國中醫科學院針灸研究所動物倫理委員會審查批準，實驗動物倫理學審查批準號中科針倫D2019-12-25-1。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

清潔級成年雄性SD大鼠24只，體質量(220±10)g，隨機分為正常組、輕刮痧組、中刮痧組和重刮痧組每組各6只。實驗動物由中國醫學科學院動物所提供，實驗動物許可證號SCKX(京)2016-0001。在中國中醫科學院針灸研究所動物房(清潔級)喂養，自然照明，自由攝食飲水。實驗過程參照并嚴格遵循2006年國家發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[11]進行開展。

1.2 試劑與儀器

異氟烷(中國九派制藥有限公司);羊抗5-HT抗體(批號ab66047)，美國Abcam公司；小鼠抗Mast cell抗體(批號ab2378)，美國Abcam公司；Alexa 594熒光素化的驢抗小鼠抗體，美國Molecular Probes公司；Alexa 594熒光素化的驢抗羊抗體，美國Molecular Probes公司；核酸特異性熒光染料 DAPI，美國Mo-lecular Probes公司；Alexa 488 熒光素化的鬼筆環肽，美國MolecularProbes公司。

Matrx VMR小動物麻醉機(美國Midmark公司)；Thermo FSE恒冷箱切片機(德國MicromInternational公司)；BX53研究級正置顯微鏡(日本Olympus公司)；FV 1200全光譜掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；刮痧力度測量儀(天津明通世紀科技有限責任公司)。

1.3 刮痧干預

采用自行研制的刮痧力度測量儀。圖1示，穴位選取大鼠右后肢“陽陵泉”穴(距后三里上外側5 mm，腓骨小頭前下方凹陷處)穴位定位參照《實驗針灸學》“常用實驗動物針灸穴位”[12]。剃除雙后肢及下背部毛發，充分暴露“陽陵泉”穴區皮膚組織，用特制的刮痧力度測量儀對其進行干預。穴區刮拭范圍控制在15 mm×10 mm，輕刮痧組使用0.4 kgf力，中刮痧組使用0.8 kgf力，重刮痧組使用1.2 kgf力，每組均刮拭20次，干預1次，完成后即刻取材。

圖1 大鼠“陽陵泉”穴定位及操作

1.4 灌流取材

不同程度刮痧刺激后即刻對仍處于深度麻醉狀態下的大鼠進行心臟灌流，先用0.9%氯化鈉溶液沖凈血液，隨后灌入(320±10)mL含4%多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值為7.4)的固定液，約15 min灌流完畢。在灌流后大鼠右側陽陵泉穴區分別縱向切取長約15 mm、寬約10 mm的皮膚組織，將其放置于上述同樣固定液中固定2 h，再換到含25%蔗糖的0.1 mol/L PB液(pH 值為7.4)中，放置于4 ℃冰箱中約2 d，直至組織完全下沉。

1.5 熒光免疫組織化學染色

采用恒冷箱切片機進行組織切片。先用組織包埋劑將皮膚組織黏貼在支架上，待組織凍結后沿縱向制成矢狀切片，厚度為20 μm，直接貼在陽離子載玻片上，然后放于室內陰干。

1.6 觀察指標及檢測方法

組織切片用0.1 mol/L PB液清洗3次，待組織膠清洗干凈后用組化筆在組織周圍畫圈，將封閉液[3%驢血清，0.5% Triton X-100和0.1 mol/L PB(pH值為7.4)]用移液器滴加到組織切片上孵育，期間配置稀釋液[1%驢血清、0.5% TritonX-100和0.1 mol/L PB(pH值為7.4)],1 h后移去封閉液，分別滴加羊抗5-HT抗體(1∶500)、小鼠抗MC抗體(1∶1000)的稀釋液，并將裝有組織切片的濕盒置于4 ℃冰箱中過夜。次日經0.1 mol/L PB液清洗3次后，加入含Alexa 594熒光素化的驢抗小鼠抗體(1∶500)、驢抗羊抗體(1∶500)、Alexa 488熒光素化的鬼筆環肽(1∶500)、核酸特異性熒光染料DAPI(1∶50000)的上述稀釋液，于室溫內靜置2 h后，用0.1 mol/L PB液清洗3次。待組織切片風干后，滴加50%甘油，加蓋玻片完成標本制作。整個操作過程中注意避光。

組織標本用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察及拍照。圖片進行標注和編輯,之后先進行局部組織皮膚形態觀察，再對每組組織切片在熒光顯微鏡10倍視野下分別選取12個面積相同的區域進行肥大細胞(mast cell，MC)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)計數。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 不同程度刮痧對大鼠“陽陵泉”穴區局部組織皮膚的影響

圖2示，輕刮痧組大鼠皮膚變化不明顯，輕微發紅，有少量痧點；中刮痧組出痧較多，皮膚普遍發紅，皮下充血明顯；重刮痧組出現一定皮膚受損并伴有皮下出血，說明重刮痧會引起皮膚組織損傷。

圖2 不同力度刮痧后大鼠情況(從右至左依次為正常組、輕刮痧組、中刮痧組、重刮痧組)

2.2 不同程度刮痧對大鼠“陽陵泉”穴區局部組織免疫熒光染色檢測結果

通過免疫熒光結果觀察到，輕刮痧組皮膚組織形態無明顯變化，中刮痧組表皮層結構排列紊亂，少數毛囊發生破裂，重刮痧組皮膚組織形態明顯紊亂，毛細血管破裂，真皮下層及皮下組織未見完整血管結構。“陽陵泉”穴區局部組織的表皮層、真皮層和皮下組織均有5-HT和MC的陽性標記，與空白組比較(圖3 A、5A)，輕刮痧組(圖3B、5B)在真皮層和皮下組織中沿毛囊與血管形成連續的增強帶；中刮痧組(圖3C、5C)陽性標記呈下降趨勢；重刮痧組(圖3D、5D)陽性標記明顯減少。

圖4示，通過對5-HT和MC的陽性標記數進行統計觀察到，與空白組比較輕刮痧組5-HT陽性標記數明顯升高(P<0.01)，中刮痧組5-HT陽性標記數無統計學意義(P>0.05)，重刮痧組5-HT陽性標記數降低(P<0.05)。圖6示，與空白組比較，輕刮痧組MC陽性標記數明顯升高(P<0.01)，中刮痧組MC陽性標記數無統計學意義(P>0.05)，重刮痧組MC陽性標記數顯著降低(P<0.01)。

注：空白組(A,A1)；輕刮痧組(B,B1)；中刮痧組(C,C1)；重刮痧組(D,D1)；5-HT(紅)；PHA(綠)；DAPI(藍)染色對比圖片；Epi代表表皮層，Der代表真皮層，A1、B1、C1、D1分別為圖A、B、C、D中白色方框標記處的放大圖片

注：與空白組比較：輕刮痧組P<0.01,重刮痧組P<0.05

注：空白組(A,A1)；輕刮痧組(B,B1)；中刮痧組(C,C1)；重刮痧組(D,D1)；Mast cell(紅)，PHA(綠)、DAPI(藍)染色對比圖片；Epi代表表皮層，Der代表真皮層，A1、B1、C1、D1分別為圖A、B、C、D中白色箭頭標記處的放大圖片

注：與空白組比較：輕刮痧組P<0.01,重刮痧組P<0.01

3 討論

本研究對于刮痧力度測量儀的創新應用，使得刮痧操作過程中力度這一指標得以量化控制，結合熒光免疫組織化學染色，從皮膚組織形態與局部化學物質活性的變化，探究刮痧力度對于穴區局部的效應特點。通過研究結果觀察到，輕刮痧(0.4 kgf)對大鼠局部皮膚表明影響不明顯，僅有少量痧點，真皮層與皮下組織中5-HT和MC表達升高；中刮痧(0.8 kgf)使大鼠皮膚表面發紅加重，皮下充血加重明顯，5-HT和MC表達出現下降趨勢；重刮痧(1.2 kgf)使得皮膚受損，并伴有皮下出血5-HT和MC表達降低。

“陽陵泉”穴為八會穴之“筋會”，屬于人體筋骨疼痛與膽腑病癥常用穴位，位于腓總神經分為腓淺及腓深神經處。在課題組前期研究中[13]，發現該穴位皮膚較為淺薄、出痧明顯、操作方便、易于觀察，所以選擇該穴位；同時通過研究觀察到，刮痧可以使穴區局部皮膚表皮層組織增厚，毛細血管擴張。選擇不同力度是基于臨床應用過程中的輕刮法(補法)、中刮法(平補平瀉)和重刮法(瀉法)[14]。實驗研究結果顯示，輕刮痧(0.4 kgf)和中刮痧(0.8 kgf)不會造成局部皮膚組織形態受損，重刮痧(1.2 kgf)會引起局部皮膚組織形態受損，毛細血管破裂，造成刺激嚴重，說明適度的刮痧不會引起皮膚形態損傷，刮痧過力度過大可能會使皮膚受損嚴重。本研究從實驗動物角度證明，臨床上輕(補法)和中(平補平瀉)手法是安全的，但是在應用重(瀉法)手法時需謹慎。

現代研究表明，皮膚及其與人體所連接部分能夠分泌多種激素，發揮生物學效應，并通過多種分泌機制發揮作用。該過程中刮痧可能起到推動作用[15-18]。有研究[19-20]采用刮痧法治療坐骨神經痛患者，臨床效果顯著，說明刮痧緩解疼痛方面有很好的治療作用，因此本研究選擇對5-HT進行測定。5-HT作為一種外周致痛遞質，參與機體痛覺、情緒、體溫等多種生理功能的調節，同時分布于中樞神經系統和外周組織，參與鎮痛作用的信息傳導，對相關疾病的機制具有重要意義[21-22]。課題組前期研究表明，刮痧刺激可引起人體局部皮膚組織中肥大細胞(MC)發生脫顆粒現象[23]。MC作為機體的初級免疫細胞，是人體的防御系統，主要分布在皮膚真皮層及皮下組織，尤其在經穴區域數目較多，是人體免疫、內分泌、神經等系統信號的放大和調節細胞，對于維持人體系統平衡有重要作用[24]。通過實驗結果觀察到，輕刮痧對穴區組織中5-HT和MC的表達起到顯著上調作用，中刮痧開始出現下降，重刮痧明顯減少，提示刮痧的作用機制可能與其所產生的生物學效應有關。結合前期研究[25]更加肯定認為，刮痧調節穴區局部皮膚組織中化學物質的變化，可能是刮痧產生效應的重要環節之一。輕刮痧能更有效地激活穴區局部皮膚中的各類細胞，促使相關激素和活性物質的釋放，有助于刮痧對人體產生良好的調節作用，但是更大力度的刮痧效果不佳，又或對于不同的機體狀態能產生一定的作用，有待進一步研究。通過本研究對這2種化學物質的變化趨勢說明，適度刮痧會引起局部皮膚化學物質的表達響應變化，刮痧后穴區局部組織響應不會隨著刮痧力度的增加而增加，甚至出現相反的變化趨勢。

綜上所述，刮痧的作用與刮痧力度有著一定的聯系，且輕刮痧(0.4 kgf)更適用于大鼠實驗研究，有助于提升穴區局部化學物質的表達，并非力度越大越有效;重刮痧手法會對皮膚造成損傷，使局部皮膚嚴重受損且形態紊亂，毛細血管破裂，這可能是導致活性物質表達降低的重要原因，在臨床應用時應慎重考慮。輕刮痧對于皮膚組織中5-HT的提升，推測該手法在臨床應用過程中起到一定的抗炎鎮痛作用，而對于MC的提升，說明該手法有助于MC在穴區聚集，推動免疫、神經、生長等因子的釋放，推測有增強機體免疫力、促進機體恢復的作用；同時在課題組前期研究工作中觀察到，重刮痧可增加動物與人體穴區局部血流灌注量，提高局部溫度，起到促進代謝、活血通絡的作用[26-28]，說明該手法可能對于寒性疾病和慢性疾病恢復有一定的效果。推測穴區局部血流灌注量、溫度和皮膚形態產生的變化，可能是影響穴區局部活性物質表達變化的主要因素,而力度是對于這些因素造成影響的直接原因。最后需要說明的是，本研究只局限于動物實驗并且采用健康的動物模型，對于應用于人體以及不同疾病的最佳刮痧力度還需進一步考究；同時在研究過程中作為固定變量的刮痧次數也是影響刮痧程度的關鍵因素。在今后研究中有待進一步拓展刮痧力度、次數與出痧程度間的相互關系，為今后實驗指導和科學規范刮痧的臨床應用提供實驗基礎，促進刮痧的發展與傳承。