基于生物信息學分析探究盤狀紅斑狼瘡的關鍵通路、基因及免疫細胞浸潤①

魏姍姍 閆 璐 邱賢文 賴 寬 米向斌 南方醫科大學珠江醫院皮膚科廣州510280

紅斑狼瘡(lupus erythematosus,LE)是一種自身免疫性疾病,其發病機制尚不清楚,主要分為盤狀紅斑狼瘡(discoid lupus erythematosus,DLE)、亞急性皮膚型LE和系統性LE,其中DLE是較常見的類型,占皮膚型LE的50%～85%。DLE病因不明,可能與免疫學改變、遺傳、紫外線照射等多種因素相關,主要表現為頭面、頸部等出現邊界清楚的盤狀紅斑或斑塊,伴輕度瘙癢,部分患者可出現輕度關節疼痛及光過敏等癥狀[1]。目前臨床上多采用糖皮質激素、抗瘧藥等對癥治療,雖然取得了一定療效,但仍存在皮膚黏膜萎縮、感染和復發等風險,影響患者免疫功能、外觀和生活質量,極少數患者演變為其他皮膚惡性腫瘤[2]。隨著高通量研究方法的應用,高通量數據分析及信息篩選成為重要研究手段[3]。本文通過挖掘NCBI的基因表達匯編(gene expression omnibus,GEO)數據庫中DLE的基因芯片數據(GSE81071),將微陣列技術與生物信息學分析相結合,篩選差異表達基因(differential expressed genes,DEGs),采用DAVID、STRING、CIBERSORT等數據庫進行DLE相關DEGs的功能富集分析、信號通路分析及核心基因識別[4]。既往研究發現DLE發病與局部免疫細胞浸潤密切相關,傳統的DEGs研究方法側重于單個基因,本文首次采用CIBERSORT對其進行22種免疫細胞浸潤分析,旨在更深入地了解DLE的發病機制,為尋找其治療靶點和預防新方案提供方向。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數據 從GEO數據庫GSE81071獲取數據集,基于GPL19983平臺([HuGene-2_1-st]Affymetrix Human Gene 2.1 ST Array),由Berthier CC等提交,包括60個樣本,其中DLE皮膚組織47例和正常皮膚組織13例。

1.2 DEGs篩選 采用R語言對芯片數據進行背景校正、標準化、匯總和探針質量控制,下載注釋包進行ID轉換,提取表達矩陣,加載limma包,以P＜0.05、|logFC|＞1.5為標準篩選DEGs,繪制熱圖和火山圖。

1.3 功能富集分析 采用DAVID在線工具對DEGs進行功能富集分析,上傳DEGs至列表后,得到生物學過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細胞成分(cellular component,CC)及KEGG通路的富集分析結果。

1.4 蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡構建及分析 采用STRING數據庫構建DEGs相應PPI,綜合得分＞0.7的蛋白具有統計學意義。采用生物信息學繪圖軟件Cytoscape(3.7.2)中的CytoHubba插件計算各蛋白節點的連接程度并進行多種算法評分,采用5種算法篩選核心基因[5-6]。

1.5 免疫細胞浸潤矩陣分析 采用R軟件和CIBERSORT(https://cibersort.stanford.edu/)及其提供的22種免疫細胞轉錄特征矩陣得到DLE表達譜矩陣[7]。對其進行1 000次模擬計算,獲得22種免疫細胞浸潤分布。篩選P＜0.05的樣本進行后續分析。

2 結果

2.1 DEGs篩選 共篩選出214個DEGs,其中上調基因178個,下調基因36個。采用R語言繪制熱圖,見圖1。

2.2 GO功能富集和KEGG通路分析 GO分析顯示,DEGs主要富集的BP:免疫應答、固有免疫應答、防御反應、對其他生物的防御反應和對外界生物刺激的反應；主要富集的CC:細胞膜外側面、膜側、細胞表面、循環系統免疫球蛋白復合物和血液微粒；主要富集的MF:dsRNA結合、趨化因子受體結合、2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性、趨化因子活性和CXCR3趨化因子受體結合,見表1。

KEGG分析顯示,DEGs主要富集于麻疹、甲型流感病毒、單純皰疹感染、細胞因子-細胞因子受體相互作用、丙型肝炎和Toll樣受體信號通路,見表1。

圖1 DEGs熱圖Fig.1 Heatmap of DEGs

2.3 PPI分析 共篩選115個節點蛋白,499條邊,綜合得分＞0.7,P＜1.0E-16,采用5種算法對PPI網絡進行計算與篩選,選取各算法前10位基因,見表2。采用韋恩圖取5種算法結果交集,最終篩選出STAT1和OAS1 2個核心基因,STAT1網絡結節點數為32,OAS1網絡節點數為31,均＞30,說明2個基因在PPI網絡中與其他基因的聯系更強,因此較其他基因可能發揮更關鍵的作用。

2.4 免疫細胞浸潤分布 通過CIBERSORT反卷積法計算并最終得到48個可信樣本,見圖2A,左邊5個為正常組,其余43個為DLE組。免疫細胞浸潤分析結果發現,M0型巨噬細胞在各組織中均不表達。圖2B(左邊5個為正常組,其余43個為DLE組)進一步展示了22種免疫細胞的浸潤比例(對應顏色模塊大小表示占總免疫細胞比例),其中活化的NK細胞、M2型巨噬細胞及CD8+T細胞在兩組中占總免疫細胞的比例均較高。

2.5 免疫細胞浸潤差異分析 免疫細胞浸潤差異分析顯示,活化的CD4+記憶T細胞(P=0.014)、M1型巨噬細胞(P=0.005)在DLE中表達顯著上升,而活化的DCs表達顯著降低,見圖3。

表1 DEGs GO富集分析和KEGG通路分析結果Tab.1 GO enrichment and KEGG pathway analysis results of DEGs

表2 5種算法獲得的排名前10的核心基因Tab.2 Top 10 hub genes from five centrality methods

圖2 DLE及正常組皮膚組織中免疫相關細胞的浸潤組成Fig.2 Infiltration composition of immune-associated cells in DLE and normal skin tissues

圖3 DLE組與正常組免疫細胞浸潤分析Fig.3 Infiltration analysis of immune cells in DLE group and normal group

3 討論

隨著高通量芯片技術的應用,生物信息學方法可以更加快速、高效地篩選出與疾病發生發展機制相關的核心基因,為疾病的診斷、治療及新藥物設計提供了依據。本研究發現DEGs主要富集于細胞膜外側面、膜側和細胞表面中,通過調節dsRNA結合、趨化因子受體結合與活性等參與免疫應答、固有免疫應答、防御反應等BP,與DLE的發病機制相關[8-9]。既往研究發現,DLE皮損區炎癥細胞因子(如IL-1、IFN-γ、IL-6)及細胞內黏附分子、趨化因子高表達,促進免疫細胞募集至皮膚[9]。KEGG信號通路分析顯示,DEGs主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用、Toll樣受體、病毒感染等信號通路。細胞因子-細胞因子受體相互作用通路中表皮巨噬細胞、T細胞和其他細胞相互作用產生IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-17等多種細胞因子和趨化因子,通過多種途徑放大炎癥因子效應,導致固有免疫和適應性免疫相互干擾,參與DLE發生發展[9-10]。Toll樣受體信號通路中,Toll樣受體通過巨噬細胞、T細胞等免疫細胞對先天性和后天性免疫應答起重要作用,研究表明DLE可通過Toll樣受體通路促進功能性CD11c+NK等新興淋巴細胞生成引發強大的先天免疫應答[11]。

目前關于麻疹和LE的研究較少,部分報道稱麻疹患者LE發病率較健康對照組提高,但具體機制需進一步研究[12]。研究顯示,與對照組相比,狼瘡小鼠在甲型流感病毒急性感染過程中產生更多的特異性T細胞,雖然感染期間不會加快疾病進展,但病毒清除后持續的炎癥反應可能導致病情加重[13]。

本研究采用5種算法計算取交集得到2個核心基因,其中OAS1又稱寡腺苷酸合成酶1,可被dsRNA激活作用于寡聚化ATP酶調節2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性。OAS1是IFN的調控基因,可通過調控IFN活性而在細胞因子-細胞因子受體相互作用、Toll樣受體、病毒感染等通路中發揮重要作用。STAT1是一種可與DNA結合的蛋白家族,可通過調控及反調控多種細胞因子和生長因子起免疫調節作用。既往研究表明,IFN-α、dsRNA可激活JAK1-STAT1通路調控LE患者T、B細胞活化、抗體分泌、自噬等。靶向JAK/STAT蛋白可同時抑制多種細胞因子(如IFN-α、IFN-γ)治療LE[14]。此外,CHONG等[15]在DLE患者皮膚組織中發現STAT1表達升高,且與巨噬細胞功能和活性相關。

綜上可知,DEGs與免疫應答、固有免疫應答、細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子等密切相關,研究證實表皮中的T細胞、活化的DCs、巨噬細胞、B淋巴細胞和其他細胞相互作用產生多種細胞因子和趨化因子與DLE進展密切相關[9-10]。本研究采用CIBERSORT對DLE皮膚組織中的22種免疫細胞進行浸潤分析。CIBERSORT被稱為計算機流式細胞術,是一種新興的基因表達譜分析方法,反卷積算法輸入模式化的細胞轉錄表達矩陣可重建組織測序中各種原始細胞類型和數量,已成功應用于癌癥和癌旁組織免疫細胞浸潤狀態分析,揭示腫瘤異質性對癌癥的影響[7,16]。本研究首次將CIBERSORT應用于DLE皮膚組織的免疫細胞浸潤分析,相比于正常組織,DLE組織活化的CD4+記憶T細胞、M1型巨噬細胞數明顯增加,而活化的DCs明顯減少。LE患者血液系統和DLE皮膚組織中,CD4+、CD8+記憶及效應T細胞比例均較正常組升高,DLE患者局部皮膚微環境TGF-β、IL-2、IL-17等炎癥因子可提高CD4+記憶T細胞比例和增殖活化,但由于活化性CD4+記憶T細胞獲取困難,在DLE中的報道較少[8]。M1型巨噬細胞是可高效呈遞抗原的iNOS表型特征分子,可分泌IL-1β、IL-10、TNFα等多種細胞因子,在LE發病過程中具有重要作用[17]。M1和M2型巨噬細胞可由局部免疫刺激和病原體作用而極化,如Toll樣受體和IFN-γ可誘導M1極化,而IL-4/IL-13、免疫復合物(M2b)、IL-10可誘導M2極化[18]。M1/M2的極化狀態和相互作用與機體通路、細胞因子相關,DLE DEGs主要通過病毒防御和Toll樣受體信號通路影響DLE發展,同時可誘導巨噬細胞由M2型向M1型極化。DCs是目前功能最為強大的專職抗原提呈細胞,在LE患者中的增殖活化存在爭議,最近一項單細胞組學分析發現,LE患者血液系統中DCs數顯著多于對照組,且與疾病活動度相關；但也有報道稱LE患者血液系統中DCs比例顯著降低,且漿細胞樣DCs與LE疾病活動及狼瘡腎損傷相關[19-20]。MéNDEZREGUERA等[21]研究發現,DLE患者皮膚組織中傳統DCs增加,且低表達PD-L1和高表達CCR6。本研究通過免疫細胞浸潤研究發現DLE患者皮膚組織中活化的DCs較正常組減少,其具體機制尚不清楚,可能由于表皮中活化的CD4+記憶T細胞或巨噬細胞可誘導DCs凋亡,或分泌的細胞因子抑制DCs產生、成熟和聚集。

綜上所述,本研究采用多種生物信息學方法探討了DLE可能的發病機制,DEGs主要通過細胞因子-細胞因子受體相互作用、病毒防御等調控局部炎癥反應,進而作用于M1巨噬細胞和活化的CD4+記憶T細胞和DCs參與DLE發生發展。本研究篩選出的2個核心基因STAT1、OAS1和3個免疫細胞,后續將采用前瞻性大樣本研究進一步篩查DLE的高靈敏性、特異性的診斷標記物以減少創傷性檢查,為DLE的早期診斷和靶向藥物研究提供參考。