高脂飲食誘導肥胖小鼠白色脂肪組織中IL-33的表達及意義①

開 悅 劉 虎 王文茜 宋苗苗 王玉冰 謝 赟 馬藝源 唐 穎 宋向鳳新鄉醫學院免疫學教研室新鄉453003

肥胖是由遺傳、飲食、生活方式和環境等多種因素相互作用而引起的一種綜合征[1]。近年來肥胖人數在全球范圍內逐年升高,免疫平衡失調是其發病機制之一[2]。脂肪是人體的重要組成部分,按分布部位的不同可將其分為皮下脂肪和內臟脂肪,它們的作用不完全一樣,一般認為內臟脂肪的含量與代謝性疾病的關系更為密切[3-4]。IL-33是新發現的IL-1家族的細胞因子,誘導Th2細胞、ILC2細胞、Treg細胞、M2型巨噬細胞和嗜酸性粒細胞分泌IL-4、IL-5和IL-13[5-6]。近年來一些研究報道IL-33與肥胖發生的關系,但結果并不完全一致,而不同類型的白色脂肪組織內IL-33的表達情況還未見報道。本研究探討在肥胖發生發展中IL-33的表達水平和意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 小鼠胚胎成纖維細胞(前脂肪細胞)3T3-L1細胞株購于北京協和細胞資源中心。

1.1.2 實驗動物 6～8周齡的C57BL/6雄性小鼠(22～25 g)購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。在恒定的環境條件下,12 h的明暗交替周期飼養,動物自由攝食及飲水。

1.1.3 試劑與儀器 高糖DMEM培養基購于美國Gibco公司,胰島素購于江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司,IL-33 ELISA試劑盒購于美國Biolegend公司,小鼠高脂飼料購于美國Research diets公司,Western blot所用抗體購于美國Abways公司和Proteintech公司,RT-PCR所用試劑盒購于日本TaKaRa公司。倒置顯微鏡購于日本Nikom公司,化學發光成像儀購于法國Vilber lourmat公司,實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific,Quant-Studio5)購于美國Thermo Fisher Scientific公司,酶標儀(SpectraMax iD3)購于美國Molecdar Devices公司。

1.1.4 基因引物序列 RT-PCR所用的引物堿基序列由上海生工合成,序列如下:β-actin:上游:5′-GAAATAGTGCGTGACATCAAAG-3′,下游:5′-TGTAGTTTCATGGATGCCACAG-3′；IL-33:上游:5′-CGGATCCACTTCACTTTTAACACAGTC-3′,下游:5′-GAGATCTTTAGATTTTCGAGAGCTTA-3′。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及誘導分化 3T3-L1前脂肪細胞按常規方法培養在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中。誘導分化的誘導劑為含地塞米松、IBMX、胰島素和10%胎牛血清的高糖DMEM。細胞培養和誘導分化條件均為5%CO2和37℃。

1.2.2 實驗動物及造模 6～8周齡的C57BL/6雄性小鼠在SPF級別的動物飼養室中正常飲食適應性飼養1周后隨機分為對照組(ND)和高脂組(HFD),每組5只小鼠,分別給予充足的正常飼料和高脂飼料飼養10周。在此期間每隔1周稱重,記錄2組小鼠的體重變化。高脂飲食誘導的肥胖小鼠造模成功的標志為HFD組小鼠體重為ND組體重的130%以上。

1.2.3 全自動生化分析儀測血糖血脂 小鼠禁食10 h,麻醉后眼球取血,室溫靜置1 h,待血液自然凝固,分離血清,用全自動生化分析儀檢測小鼠空腹血糖和血脂。

1.2.4 ELISA 按1.2.3方法分離小鼠血清,取2倍稀釋后的血清50μl,按說明書檢測小鼠血清中的IL-33,用雙波長法測定OD值,再根據標準曲線換算出濃度。

1.2.5 Western blot 小鼠禁食10 h,麻醉后頸椎脫臼法處死小鼠,20 min內解剖腹部取出皮下和內臟脂肪組織,分別取0.1 g組織在液氮中研磨,用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解組織中的總蛋白,總蛋白變性后電泳、電轉,封閉后用稀釋1 000倍的一抗孵育過夜,再用5 000倍稀釋后的HRP標記的二抗孵育1 h,化學發光成像儀檢測總蛋白中目的蛋白的含量。

1.2.6 RT-PCR 按1.2.5方法取出皮下和內臟脂肪組織,分別取0.1 g組織在液氮中研磨,TRIzol法提取出組織中的總RNA,進行逆轉錄和RT-PCR,檢測出擴增基因片段的Ct值,用2-ΔΔCt法計算出其相對表達量。

1.3 統計學方法 實驗結果均采用Graphpad Prism Version 8.1軟件分析,結果用3次獨立實驗的描述,用Student′st-test比較差異,P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3T3-L1細胞誘導分化后IL-33的自我調節3T3-L1細胞加誘導劑誘導分化10 d后,細胞內的IL-33含量明顯升高(圖1A,P＜0.05),但ELISA檢測的細胞培養上清中IL-33含量無顯著變化(圖1B,P＞0.05),與蛋白水平相反的是,細胞在誘導分化后IL-33 mRNA表達下調(圖1C,P＜0.05)。

2.2 高脂飲食對小鼠脂肪組織的影響 C57BL/6小鼠7周齡開始高脂飲食誘導肥胖模型,高脂飲食HFD小鼠從高脂飲食2周時體重就明顯高于ND小鼠,10周后,HFD小鼠體重遠遠超過ND小鼠(圖2A,P＜0.05)。兩組小鼠的皮下脂肪組織(subcutaneous adipose tissue,SAT)和內臟脂肪組織(visceral adipose tissue,VAT)重量也都存在顯著的統計學差異(圖2B,P＜0.05)。

2.3 高脂飲食促使小鼠糖代謝及脂代謝紊亂 高脂飲食10周后,取小鼠血清用比色法檢測空腹血糖和血清脂代謝指標,結果顯示與ND組的小鼠相比,NFD組的肥胖小鼠空腹血糖水平明顯升高,血清中膽固醇(TC)和高密度脂蛋白(HDL)含量升高(圖3,P＜0.05),但血清中三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白(LDL)無顯著變化。

2.4 高脂飲食誘導的小鼠血清中IL-33水平升高ELISA測定結果顯示,與ND組的小鼠相比,NFD組肥胖小鼠血清中IL-33含量顯著升高(圖4,P＜0.05)。

2.5 高脂飲食誘導的肥胖小鼠不同類型的白色脂肪組織中IL-33的水平 Western blot的結果證明,與ND組的小鼠相比,NFD組的肥胖小鼠SAT組織中IL-33的蛋白表達水平升高(圖5A,P＜0.05),而RT-PCR的結果顯示,HFD小鼠的SAT中IL-33 mRNA的表達反而降低(圖5B,P＜0.05)。與SAT組織相反,HFD小鼠的內臟脂肪組織中IL-33的蛋白表達水平比ND小鼠顯著降低(圖5C,P＜0.05),而RT-PCR的結果顯示,HFD小鼠的VAT中IL-33 mRNA的表達升高(圖5D,P＜0.05)。

圖1 3T3-L1細胞誘導分化對IL-33的影響Fig.1 Effect of 3T3-L1 cells induced differentiation on IL-33

圖2 高脂飲食誘導對小鼠體重和白色脂肪組織的影響Fig.2 Effects of high-fat diet on body weight and white adipose tissue in mice

圖3 高脂飲食誘導的小鼠空腹血糖、血清脂代謝指標的變化Fig.3 Changes of fasting blood glucose and serum lipid metabolism in high-fat diet induced mice

圖4 高脂飲食誘導的小鼠血清中IL-33的水平Fig.4 Serum IL-33 concentrations in high-fat diet induced mice

圖5 高脂飲食誘導的肥胖小鼠不同白色脂肪組織中IL-33的水平Fig.5 IL-33 expression in different white adipose tissue of mice induced by high-fat diet

3 討論

肥胖及其相關疾病的發病率在世界各地不斷上升。根據世界衛生組織和經濟合作與發展組織的流行病學報告,肥胖是全球第五大死亡原因之一[1]。肥胖及其相關的代謝性疾病已經成為目前科學研究的熱點。現在人們已經認識到肥胖的心血管風險更多的與身體脂肪分布有關,而不是全身脂肪總量。據報道中心型肥胖的人比婦臀大肌、外周或女性肥胖的人患肥胖相關疾病的風險更大[3]。與皮下區域的脂肪不同,出現在胸腔、腹腔、盆腔臟器周圍的脂肪稱為內臟脂肪,性腺、腎臟、腸系膜等周圍的脂肪組織均屬VAT。SAT與VAT的脂肪細胞類型、內分泌功能、脂解活性和對胰島素及其他激素的反應不同。與SAT相比,VAT具有更多的細胞性、血管性、神經支配性,脂肪細胞代謝活性更強,對胰島素更有抵抗力,比SAT更能預測死亡率[3]。所以更多的研究者把目光聚焦在VAT中炎癥與肥胖及其相關代謝性疾病的關系上[4-8]。前期研究也發現了肥胖可以使VAT內的炎癥持續存在[2]。與VAT不同,SAT表現出一些保護內分泌和炎癥的特性,這也許可以解釋為什么有些人長期肥胖卻仍然代謝健康[9]。由此可見,不同部位脂肪組織對肥胖所致慢性炎癥的影響是截然不同的。

IL-33(又稱IL-1F11)是新發現的IL-1家族的第11位成員,是具有雙效型的炎癥早期誘導劑。IL-33表達在多種細胞類型中,當細胞受應激或炎癥刺激后,會被動釋放或主動分泌IL-33,通過NF-κB和MAPK途徑,可刺激包括Th2細胞、Treg細胞、ILC2細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞在內的多種免疫細胞分泌IL-4、IL-5、IL-13[10-13]。IL-33在肥胖過程中對脂肪組織炎癥的發生起保護作用[6]。據報道,在肥胖Wistar大鼠和高脂飲食誘導的C57BL/6J肥胖小鼠脂肪組織中IL-33 mRNA表達升高[14-15]。在肥胖小鼠脂肪組織中,IL-33的表達并沒有升高,而肥胖Zucker大鼠脂肪組織中IL-33的mRNA水平反而降低[15-16]。從以上研究可以看出,IL-33在肥胖狀態下的表達有著不同的結果,推測這些不同結果的原因可能是小鼠品系的差別和脂肪組織的類型不同。

本研究探討了IL-33在肥胖發生中的變化。前脂肪細胞誘導分化后的成熟脂肪細胞IL-33蛋白水平升高,細胞培養上清中IL-33含量無明顯變化,所以細胞在誘導成熟過程中合成的IL-33并沒有分泌至胞外,而是貯存在細胞內,待細胞應激或損傷后作為警報素釋放出來[8,17]。3T3-L1細胞內組成性表達的IL-33隨著脂質的增多不斷積累,其mRNA的表達反而下降,這說明IL-33在細胞儲存脂質的過程中,存在自身基因水平的負反饋調節。利用高脂飲食誘導C57BL/6成年雄性小鼠10周,建立小鼠肥胖模型,與同周齡正常飲食的小鼠相比,肥胖小鼠的體重、SAT和VAT的重量均明顯升高,代謝指標紊亂。實驗數據表明IL-33在肥胖小鼠血清和皮下脂肪組織中含量增多,這與細胞實驗結果一致,說明肥胖時機體能通過上調IL-33來糾正其帶來的炎癥代謝紊亂。VAT中的IL-33含量下降,證明了VAT在肥胖的炎癥中起到與SAT正好相反的促進作用[3,9]。另外,皮下和內臟脂肪組織中IL-33的mRNA相對表達水平與其蛋白水平的趨勢相反,這與細胞實驗結果正好吻合,說明脂肪組織內部也存在負反饋機制,以調節IL-33蛋白水平的表達失衡。

總之,在肥胖狀態下IL-33在不同類型的白色脂肪組織內表達是不同的,這與脂肪沉積的部位有關,而且在脂肪組織中存在的負反饋機制可能對肥胖及其相關疾病的發生起到抑制的作用。