miR-150調控PDCD4對結核分枝桿菌H37Rv感染THP-1巨噬細胞的影響①

楊盛婭 孫亞萍 劉立賓 盛云峰 鮑志堅 浙江省中西醫結合醫院杭州310007

結核病(tuberculosis,TB)是由結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的,嚴重危害人類健康的一種肺部慢性傳染性疾病[1-3]。根據世界衛生組織的報告,在全球范圍內,2018年約有1 000萬人罹患TB,死亡人數約120萬[4]。中國是世界第二大肺結核易感國家,結核感染比例約占全球總數的9%[3-4]。目前臨床上以痰培養MTB陽性作為診斷肺結核的金標準,而MTB生長緩慢且培養周期較長,不利于患者的早期診斷及治療[5]。因此,仍迫切需要進一步篩選更具敏感性、準確性的生物學標志物,簡便的診斷方法及深入的機制探討,為肺結核患者臨床治療提供分子水平的理論指導。

隨著近年深入的機制探討,研究發現肺結核能夠引起多種細胞因子活化,單核巨噬細胞浸潤擴大,誘發炎癥級聯反應[3,6]。MTB是一類典型的胞內寄生菌,通過飛沫、呼吸道傳播侵入機體,最終可被巨噬細胞識別,并使巨噬細胞釋放TNF-α等炎癥因子,從而抑制MTB的生長及進一步擴散。同時,TNF-α致敏周圍T淋巴細胞,釋放其他細胞炎癥因子,包括IFN-γ、IL-1β等,促使Th1/Th2比例平衡形成及介導效應T細胞的直接殺傷作用[7]。然而,對于人體中MTB感染巨噬細胞的有效診斷及治療策略依然有限。巨噬細胞是MTB的主要靶細胞和寄居場所,為MTB感染免疫的主要效應細胞[8]。MTB感染機體初期,巨噬細胞的凋亡是機體內MTB繼續生長、擴散的重要先天性防御機制[9]。因此,加強細胞炎癥因子水平變化及細胞凋亡的研究能夠為肺結核發病及其機制探討提供新思路、新途徑。

微小RNA(microRNAs,miRNA)廣泛存在于真核生物,高度保守,長約18～22 bp,為單鏈非編碼RNA小分子,能與對應的靶基因3′-非翻譯區(3′-untranslated region,3′-UTR)非完全或完全配對結合,從而在基因轉錄后水平調控靶基因mRNA的表達水平[10-11]。同時,miRNA的異常表達與多種生物過程密切相關,如細胞分化、細胞增殖、凋亡等。ZHANG等[12]通過對肺結核患者與健康人的血液進行miRNA和mRNA表達譜的綜合分析,發現41種miRNA存在差異性表達,其中miRNA-150顯著下調。然而,侯杏芳等[13]指出miRNA-150在TB患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中表達水平顯著升高,尤其是涂陽患者,可能具有診斷TB的臨床價值。同時研究者發現,miR-150顯著增強動脈粥樣硬化中的炎癥反應,并可預測膿毒血癥患者的生存獲益,抑制脂多糖(LPS)介導的人臍靜脈內皮細胞的炎癥反應及凋亡[14-15]。另一方面,在高濃度葡萄糖處理的心臟成纖維細胞中抑制miR-150減輕心臟炎癥和纖維化[16]。目前對miR-150及其靶基因在肺結核中的研究較少。此外,研究表明miRNA可作為海綿吸附mRNA形成競爭性RNA機制,并在MTB感染巨噬細胞的分枝桿菌活力和炎癥因子分泌中發揮關鍵作用[17]。通過生物信息學預測,程序性細胞死亡蛋白4(programmed cell death protein 4,PDCD4)可能是miRNA-150的作用靶點之一。PDCD4是一種促凋亡基因,在人類肺、肝、腦、胰腺等組織中都有表達[18]。近年有研究發現PDCD4在肺纖維化、非小細胞性肺癌過程中低表達[19-20]。但miR-150靶向調控PDCD4對MTB感染巨噬細胞是否具有調節作用尚無詳細報道。

本研究采用MTB毒株H37Rv感染THP-1細胞系,并預測miRNA-150的靶基因；通過過表達miR-150或抑制miR-150表達檢測miR-150對下游靶基因PDCD4表達的影響,進而對THP-1源巨噬細胞炎癥因子,細胞活力及凋亡進行檢測,旨在探討miR-150靶向調控PDCD4對結核桿菌H37Rv感染THP-1巨噬細胞的作用,為闡明肺結核的發生和發展機制提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系及菌株 人單核細胞THP-1、人腎上皮細胞系HEK293細胞購自中國科學院細胞庫；結核分枝桿菌毒株H37Rv菌株購自美國模式培養物研究所(American Type Culture Collection,ATCC 27294)；相關細菌實驗操作與感染均在杭州市疾控中心生物安全防護三級實驗室指導完成。

1.1.2 實驗試劑 RPMI1640培養基購自Gibco公司；CCK-8細胞活力檢測試劑盒均購自凱基公司；IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-1βELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000 Reagent購自Thermo Fisher Scientific公司；兔單克隆抗體Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9購自Abcam公司；兔抗人GAPDH抗體購自華安公司；HRP標記的二抗山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司；佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)購自美國Sigma公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡRT-PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司。miRNA-150模擬物(miRNA-150 mimic)、陰性對照模擬物(negative control mimic,NC-mimic)、miRNA-150抑制物(miR-150 inhibitor)、陰性對照抑制物(negative control inhibitor,NC-inhibitor)購自廣州銳博生物科技公司。PDCD4干擾序列(siRNA-PDCD4):5′-GCTGCTCTGGATAAGGCTA-3′和陰性對照序列(NCPDCD4):5′-GTTGAGCGACTGAGCACCGA-3′由上海生工生物公司設計合成。

1.2 方法

1.2.1 THP-1細胞培養及H37Rv感染 THP-1細胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液于37℃、5%CO2的培養箱中培養,2～3 d換液1次。THP-1細胞處于對數生長期且狀態良好時,以1×106ml,接種于6孔板,每孔細胞中加入濃度為160 nmol/L的PMA,刺激48 h后,細胞由懸浮狀態轉變為貼壁狀態,表明細胞已誘導分化為巨噬細胞。在巨噬細胞內以MOI=10∶1(H37Rv∶THP-1)加入濃度為1.0 g/L(活菌數:1.0×107CFU/ml)的細菌,共培養4 h后,PBS潤洗細胞3次,每次5 min。隨后,加入含200μg/ml阿米卡霉素的完全RPMI1640培養液,作用1 h清除細胞外分枝桿菌。再次以PBS潤洗3次,新鮮培養液加入細胞中,繼續培養24 h、36 h和48 h。qPCR檢測miR-150和PDCD4的mRNA表達水平,ELISA法檢測細胞培養液中IFN-γ及炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)含量。

1.2.2 CCK-8法檢測H37Rv感染THP-1巨噬細胞活性 在96孔板中加入1×105個THP-1細胞,經PMA及H37Rv誘導后,利用LipofectamineTM2000分別轉染 miRNA-150 mimic、NC-mimic、miR-150 inhibitor及NC-inhibitor。miRNA-150 mimic轉染終濃度為100 nmol/L,miR-150 inhibitor轉染終濃度為200 nmol/L,共培養48 h。每孔加入CCK-8檢測液10μl,37℃培養4 h,酶標儀在450 nm測定吸光度(OD)值。細胞活力=[OD實驗組-OD空白組]/[OD對照組-OD空白組]×100%；對照組細胞活力為100%。miRNA-150 mimics序 列 為:5′-GCCGAATTCGCATAGGGTGGAGTGGGTGT-3′,miR-150 inhibitors序列為:5′-GATCCCCCACTGGTACAAGGGTTGGGAGA-3′。

1.2.3 miR-150潛在靶基因的預測 miRNAs通過海綿作用吸附內源性RNA分子調節靶基因表達。本研究運用StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)、Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_71/)、miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)和 miRSystem(http://mirsystem.cgm.ntu.edu.tw/index.php)數據庫,以“miR-150”為關鍵詞,檢索其潛在靶基因。通過Venny2.10(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)線上工具繪制韋恩圖并取交集,從而獲得miR-150潛在作用靶基因。

1.2.4 熒光定量PCR檢測THP-1巨噬細胞中miR-150和PDCD4表達 THP-1巨噬細胞分別轉染miR-150 mimic和miR-150 inhibitor后,加入1 ml TRIzol試劑,依據TRIzol試劑說明書提取細胞樣本的總RNA。以One-Step miRNA RT Kit反轉錄制備cDNA。熒光定量PCR采用SYBR法,在ABI 7500 Fast Real Time PCR System進行PCR擴增,檢測miR-150和PDCD4的mRNA表達水平。擴增條件:95℃預變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火30 s,變性和退火步驟40個循環。引物序列如下:miR-150,F:5′-CTGCTTAGTGGCTCTACTCCTG-3′,R:5′-TCCCCTCTGGCTTATGTCC-3′；U6 F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；PDCD4 F:5′-AAGAAAGGTGGTGCAGGAGG-3′,R:5′-TGACTAGCCTTCCCCTCCAA-3′；GAPDH F:5′-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3′,R:5′-GCATCACCCGGAGGAGAAAT-3′。分 別 以U6和GAPDH為 內 參 基 因,以2-ΔΔCt計 算miRNA-150、PDCD4相對表達量。

1.2.5 熒光素酶活性檢測 將miRNA預測靶基因PDCD4的3′UTR克隆到熒光素酶報告載體上。由上海康成生物工程有限公司完成野生型(WT)突變型(MUT)PDCD4 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因質粒的構建和鑒定。取對數生長期的HEK293細胞,根據脂質體LipofectamineTM2000說明書操作步驟進行,將miRNA-150 mimics和NC-mimic及WT和MUT PDCD4 mRNA 3′UTR共轉染至HEK293細胞。同時加入100μl海腎熒光素酶(pGL-TK)作為熒光霉素活性的檢測參照。轉染后24 h使用Promega公司的雙熒光素酶檢測系統和熒光素酶檢測儀檢測熒光素酶含量。

1.2.6 miRNA及siRNA轉染至THP-1巨噬細胞將miR-150 inhibitor及PDCD4-siRNA單獨及共同轉染至H37Rv感染的THP-1巨噬細胞。ELISA法檢測細胞培養液中IFN-γ及炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)含量,Western blot法分析轉染細胞Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表達水平。

1.2.7 Western blot分析 采用細胞裂解液裂解各組THP-1巨噬細胞以提取總蛋白,經BCA蛋白定量檢測試劑盒進行定量。取含20μg蛋白的裂解液,經10%SDS-PAGE 120 V電泳,再轉移至PVDF膜,以5%脫脂奶粉封閉1 h,加入特異性一抗于4℃過夜孵育。次日PBST漂洗3次,每次10 min后,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體,孵育2 h,經ECL曝光成像。

1.3 統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行統計學分析。所有數據以表示,兩組間比較采用t檢驗,多組比較采用單因素One-ANOVA方差分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。使用受試者工作特征(ROC)曲線分析診斷敏感度及特異度。

2 結果

2.1 H37Rv促進THP-1巨噬細胞炎癥因子的釋放ELISA結果顯示,與正常培養THP-1源巨噬細胞相比,IFN-γ、IL-1β、TNF-α與IL-6的含量在H37Rv感染THP-1細胞中顯著升高,且呈時間作用依賴性(圖1)。

2.2 miR-150促進THP-1巨噬細胞活性 在THP-1巨噬細胞中過表達miR-150后,細胞的活性較NCmimic組明顯升高(P＜0.01)；當miR-150表達被抑制后,細胞相對活性相比NC-inhibitor組有所下調(P＜0.05)。見圖2。

圖1 炎癥因子在H37Rv感染THP-1巨噬細胞的情況Fig.1 Condition of inflammatory cytokines in H37Rvinfected THP-1 macrophage

圖2 CCK-8檢測THP-1巨噬細胞分別轉染miR-150 mimic和miR-150 inhibitor 24 h后細胞活力Fig.2 Cell viability of THP-1 macrophage was detected by CCK-8 when transfected with miR-150 mimic and miR-150 inhibitor for 24 h

2.3 PDCD4可作為miR-150直接靶基因 miRNAs通過海綿作用吸附內源性RNA分子而調節靶基因表達。經數據庫分析獲知PDCD4可能為miR-150的候選靶點(圖3A)。qPCR結果顯示,miR-150 mimic抑制PDCD4 mRNA表達,而在miR-150 inhibitor組中PDCD4 mRNA表達顯著升高(圖3B、C,P＜0.05)。圖3D為miR-150與PDCD4的3′-UTR的結合位點。熒光雙素酶報告實驗顯示,熒光素酶活性在WT型PDCD3 3′-UTR質粒與miR-150 mimic共轉染下顯著降低(P＜0.01),而MUT型PDCD4 3′-UTR質粒與miR-150 mimic共轉染未見明顯差異(圖3E)。結果表明miR-150和PDCD4的基因表達相關。

圖3 miR-150負向調控PDCD4的表達Fig.3 miR-150 negatively regulates expression of PDCD4

圖4 共轉染miR-150 inhibitor與PDCD4-siRNA對H37Rv感染THP-1巨噬細胞炎癥因子表達的影響Fig.4 Effect of expression on inflammatory cytokines in H37Rv-infected THP-1 macrophage with cotransfection of miR-150 inhibitor and PDCD4-siRNA

2.4 miR-150靶向作用于PDCD4調控H37Rv感染THP-1巨噬細胞炎癥因子的表達 ELISA結果顯示,在H37Rv感染THP-1巨噬細胞下,與NCinhibitor組相比,miRNA-150 inhibitor顯著抑制H37Rv感染THP-1巨噬細胞IFN-γ、IL-6、TNF-α和IL-1β的釋放(圖4,P＜0.05或P＜0.001)；此外,與miRNA-150 inhibitor+PDCD4-NC組相比,PDND2 siRNA反轉miRNA-150 inhibitor的抑制效應,促使IFN-γ、IL-6、TNF-α和IL-1β的釋放。

2.5 miR-150靶向作用于PDCD4調控H37Rv感染THP-1巨噬細胞凋亡相關蛋白的表達 Western blot結果顯示,H37Rv感染細胞后,Bcl-2蛋白表達顯著升高,而Bax及Caspase-3蛋白表達水平顯著降低。與NC-inhibitor組相比,miR-150 inhibitor組中Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05,圖5A、B),且Bax及Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P＜0.01；圖5A、C、D)。miR-150 inhibitor與PDCD4-siRNA共轉染下,miR-150 inhibitor對Bax及Caspase-3蛋白表達水平的升高效應在PDCD4-siRNA作用下所阻遏。結果表明,在巨噬細胞中,在miR-150可能通過靶基因PDCD4的相互作用而參與對細胞凋亡的影響。

3 討論

圖5 H37Rv感染THP-1巨噬細胞共轉染miR-150 inhibitor和PDCD4-siRNA后凋亡相關蛋白表達水平Fig.5 Expressions of apoptosis-related proteins in H37Rv infected THP-1 macrophage with cotransfection of miR-150 inhibitor and PDCD4-siRNA

miRNAs已被證實在宿主對細胞內分枝桿菌誘導的免疫和炎癥反應中起重要作用,并可能影響結核患者巨噬細胞的炎癥功能[21]。研究發現,成人TB患者在PBMC、血清、痰液、血漿中存在差異表達的miRNA,其中miR-150、miR-125b、miR-155、miR-192、miR-144有望成為診斷TB的分子標志物[8,13]。本研究通過在H37Rv感染THP-1巨噬細胞中miR-150的檢測,發現miR-150表達顯著升高,提示PBMC中miRNA-150水平可能在一定程度上反映肺結核組織損傷的嚴重程度。

血清IFN-γ、炎癥細胞因子水平與肺結核感染發病及其進展密切相關。IFN-γ增強T細胞功能,而IL-6由Th2細胞分泌而來,能夠抑制Th1細胞介導的細胞免疫反應,造成巨噬細胞失活。本研究發現,H37Rv感染顯著增加THP-1巨噬細胞IFN-γ、IL-1β、TNF-α與IL-6含量,且含量水平隨H37Rv作用時間增加逐漸升高,呈現時間作用依賴性,該結果與FU等[22]一致。研究運用miR-150 inhibitor抑制miR-150表達水平,發現IFN-γ、IL-1β、TNF-α與IL-6含量顯著降低,提示miR-150在維持機體免疫功能上可能為正向調控因子,參與了肺結核感染發病過程。

本研究通過StarBase等miRNA靶基因預測數據庫發現miR-150可能與PDCD4存在靶向作用關系。本文通過雙熒光素酶報告檢測了miR-150與PDCD4的靶向作用關系。PDCD4參與多種生物過程,如凋亡和炎癥。LIANG等[23]發現在氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)刺激的巨噬細胞形成的泡沫細胞(動脈粥樣硬化病變的特征性病理細胞)中,共轉染miR-16 mimic和siRNA-PDCD4顯著抑制IL-6和TNF-α等促炎因子的分泌和表達。本研究結果顯示miR-150 inhibitor與PDCD4-siRNA共轉染可逆轉miR-150 inhibitor降低炎癥因子表達的效應,提示miR-150靶向調控PDCD4可能為參與TB免疫反應的機制之一。

巨噬細胞對MTB的防御機制決定MTB感染的發展與結果。致病性MTB通過抑制巨噬細胞凋亡而得以在其胞內存活、繁殖,并促進巨噬細胞壞死進而在體內進一步擴散,表明巨噬細胞凋亡是機體重要的固有免疫防御機制。本文探究miR-150變化對H37Rv感染THP-1源巨噬細胞的活力及凋亡相關蛋白的影響。相較于對照組,過表達miR-150時,細胞活力升高；在miR-150表達被抑制時,細胞活力下降且Bcl-2蛋白表達減少,Bax、Caspase-3蛋白表達增加。提示miR-150可能具有抑制巨噬細胞凋亡的作用。與此同時,miR-150 inhibitor和PDCD4-siRNA共轉染時,上述蛋白表達水平呈現相反效應。推測在巨噬細胞中,MTB可能通過上調miR-150及下調PDCD4抑制巨噬細胞凋亡,從而規避細胞對MTB的免疫清除。巨噬細胞產生促炎細胞因子是調節免疫應答過程的效應之一,并可通過自身凋亡而殺死胞內MTB,是宿主巨噬細胞抵御胞內病原體的重要機制。本研究結果表明,H37Rv感染THP-1巨噬細胞可促進細胞因子IFN-γ、IL-1β、TNF-α與IL-6產生,巨噬細胞凋亡顯著減弱,提示過度炎癥反應與MTB的免疫逃逸相關。進一步結果發現,miR-150沉默能夠通過上調PDCD4水平減弱H37Rv感染THP-1巨噬細胞IFN-γ、IL-1β、TNF-α與IL-6產生,促進細胞凋亡。

本研究證實在H37Rv感染THP-1巨噬細胞中miR-150表達水平升高,miR-150可靶向作用于PDCD4,降低PDCD4表達水平。因此,miR-150/PDCD4作用軸可能在巨噬細胞中具有抑制細胞凋亡與增強細胞活力的作用。綜上所述,在TB中,miR-150可能作為輔助診斷的重要指標,其具體作用機制仍需進一步驗證及探索。