白藜蘆醇抑制荷骨肉瘤小鼠腫瘤生長的機制研究①

童晨曦 楊雪婷 周恩俊 曾 艷 陳昌蓉 宋銀宏三峽大學醫學院三峽大學感染與炎癥損傷研究所宜昌443002

白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種廣泛存在于植物中的多酚化合物,已展示出很強的抗腫瘤效應而沒有常規化學療法的毒副作用[1-2]。RES對多種骨肉瘤細胞系具有抗增殖作用也已得到證實[3-4]。然而,RES是否具有增強骨肉瘤細胞免疫原性,從而改善腫瘤免疫微環境的作用還未知。此前有研究報道,RES能增強小鼠腎癌細胞免疫原性,同時改善腫瘤微環境以達到抑制腫瘤生長的效應[5]。RES通過增強腎癌細胞免疫原性成功發揮免疫治療作用有下述機制:誘導和增強更多相關免疫細胞正確識別和破壞腫瘤細胞的能力[6]；克服腫瘤的免疫逃逸機制,讓腫瘤細胞表達在逃逸過程中喪失的抗原,克服抗原呈遞、加工過程中的缺陷[7]。本課題組前期探討RES對體外骨肉瘤細胞系的抗增殖作用時發現,RES除了具有誘導K7M2細胞凋亡和阻滯細胞周期進程的作用外,亦有增強體內外骨肉瘤細胞免疫原性的潛力；通過增加MHCⅠ和MHCⅡ類分子的表達來提高抗原提呈能力、減弱骨肉瘤的免疫逃逸現象[8]。在此基礎上,本研究通過構建荷K7M2骨肉瘤BALB/c鼠移植瘤模型,首先探討了RES對荷骨肉瘤小鼠移植瘤的生長抑制作用,通過觀察處理后小鼠肝腎器官形態學的變化來判斷RES的毒性作用。此外,本研究在體外和體內檢測了腫瘤細胞表面PD-L1的表達變化,以及荷瘤小鼠腫瘤微環境中各種免疫細胞浸潤比例的改變；并對細胞凋亡和細胞周期相關基因和蛋白的表達變化在體內實驗中進行驗證,以期為RES臨床治療骨肉瘤提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 18只SPF級BALB/c小鼠(雌性,6～8周齡,體重16～18 g),購于三峽大學實驗動物中心,動物質量合格證號:42010200001767；在三峽大學實驗動物中心SPF級小鼠飼養室常規飼養。

1.1.2 細胞株 鼠骨肉瘤K7M2細胞購自上海中科院細胞庫。

1.1.3 主要試劑和儀器 白藜蘆醇(成都克洛瑪生物科技有限公司)；DMEM高糖培養基和胎牛血清(Gibco)；TRIzol(Reagent Invitrogen)；PCR逆轉錄試劑盒和PowerUpTMSYBR Green Master Mix(Thermo Scientific)；PD-L1純化的抗小鼠CD274抗體(貨號:124301)、AlexaFluor?488山羊抗大鼠IgG抗體(貨號:405418)、CD45-APC/Cy7熒光單克隆抗體(貨號:103112)、NK1.1-PE熒光單克隆抗體(貨號:108708)、CD8-BV510熒光單克隆抗體(貨號:100710)、CD16/32(貨號:101302)購自Biolegend公司；β-actin兔抗鼠單克隆抗體(貨號:RLT0099)、CyclinE1兔抗鼠單克隆抗體(貨號:RLT1176)、XIAP兔抗鼠單克隆抗體(貨號:RLT4913)購自Ruiying Biological；CD3-APC熒光單克隆抗體(貨號:553061)、CD11b-FITC熒光單克隆抗體(貨號:557396)、Ly-6G/Ly-6C-PerCP Cy5.5熒光單克隆抗體(即Gr1,貨號:552093)、CD4-FITC熒光單克隆抗體(貨號:557307)、CD25-APC熒光單克隆抗體(貨號:558643)、FoxP3-PE熒光單克隆抗體(貨號:563101)購自美國BD公司；Mcl-1兔抗鼠單克隆抗體(貨號:#94296)、Bcl-2兔抗鼠單克隆抗體(貨號:#3498)、Bax兔抗鼠單克隆抗體(貨號:#2772)購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(貨號:GB23303)購自武漢谷歌生物科技有限公司；Kras兔抗鼠單克隆抗體(貨號:ab180772)購自英國Abcam公司。蛋白提取試劑盒(索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific)；細胞破膜/固定試劑盒(BD公司)；FACSVerse流式細胞儀(BD公司)；Multiskan Spectrum全波長酶標儀(Thermo Scientific)；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)；GelX凝膠成像系統(上海歐翔科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 骨肉瘤K7M2細胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM,放置于37℃、5%CO2培養箱培養。隔天換液,每隔2 d傳代1次。荷瘤前24 h對細胞進行常規換液,保證細胞融合度＞80%。

1.2.2 流式細胞術檢測體外K7M2細胞表面PDL1表達 K7M2細胞用RES(20μmol/L、40μmol/L)處理48 h,對照組加入藥物處理組等體積的DMSO。收集細胞并用PBS洗滌2次,首先加入1∶100的PD-L1純化的抗小鼠CD274抗體,冰上避光孵育60 min,隨后PBS洗滌3次,加入1∶100的AlexaFluor?488山羊抗大鼠IgG抗體,冰上避光孵育30 min,流式細胞儀檢測各組PD-L1表達變化。

1.2.3 動物模型建立及分組 小鼠按照隨機對照原則分為DMSO組、RES低劑量組(50 mg/kg)、RES高劑量組(100 mg/kg)。將對數生長期的K7M2細胞消化離心,用PBS調整細胞濃度為2.5×106個/ml,注射器吸取200μl接種于小鼠右側腹皮下。接種腫瘤細胞第9天,觀察到注射處有肉眼可見腫塊形成,用游標卡尺測量體積,長徑及短徑均≥0.3 cm,判斷荷瘤成功。

1.2.4 給藥方法 溶于DMSO中的藥物儲液,用PBS溶液稀釋后,按小鼠體重分別進行相應濃度藥物瘤周注射；對照組注射含有藥物相應體積DMSO的PBS溶液。注射前將藥物充分混勻,每日注射1次。注射用藥16 d后,頸椎脫臼法處死小鼠,并收集部分移植瘤用于免疫細胞分析；另一部分移植瘤組織用于基因和蛋白的檢測；收集肝腎組織用10%甲醛固定,用于HE染色法染色,觀察其有無結構性改變,以判斷RES的藥物毒副作用。

1.2.5 主要指標檢測

1.2.5.1 RES對荷骨肉瘤小鼠移植瘤生長抑制的測定 每日用游標卡尺測量小鼠移植瘤長短徑并記錄數值,計算移植瘤體積,腫瘤體積=長徑×短徑2/2,按照所得腫瘤體積數值繪制腫瘤生長抑制曲線。

1.2.5.2 RT-qPCR檢測移植瘤組織中細胞凋亡和細胞周期相關基因表達量變化 將移植瘤組織放入適量TRIzol溶液中,用電動勻漿器研磨提取RNA,將RNA逆轉錄成cDNA。使用SYBRGreen Master Mix在StepOnePlus Real-Time PCR System儀器上進行RT-qPCR反應。β-actin作為內參,用2-ΔΔCt法計算Xiap、Kras、Bcl-2、Mcl-1、CyclinE1、BAX相對表達量。RT-qPCR反應條件:95℃45 s,56℃30 s,72℃3 min,40個循環。所有引物序列及相關信息見表1。

1.2.5.3 Western blot檢測移植瘤組織中細胞凋亡和細胞周期相關蛋白表達量變化 將移植瘤組織放入適量體積的RIPA裂解液中,電動勻漿器研磨提取腫瘤細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。用SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白,濕轉90 min至PVDF膜上,置于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,相應條帶分別加入1∶2 000的β-actin兔抗鼠單克隆抗體、CyclinE1兔抗鼠單克隆抗體和XIAP兔抗鼠單克隆抗體；以1∶2 000比例稀釋的Mcl-1兔抗鼠單克隆抗體、Bcl-2兔抗鼠單克隆抗體和BAX兔抗鼠單克隆抗體；以1∶500比例稀釋的Kras兔抗鼠單克隆抗體；于4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入1∶4 000的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗,室溫孵育1 h,ECL化學發光試劑顯色。IPP6.0對顯影出來的條帶進行分析。

1.2.5.4 流式細胞術檢測移植瘤細胞表面PD-L1表達量和移植瘤組織中CD8+T細胞、NK和NKT細胞百分比變化 獲取的移植瘤組織,去除結締組織,放入含2%胎牛血清的PBS溶液中,剪碎、研磨擠壓成單細胞懸液。96孔U型微孔板上設置空白對照組、抗體單標記組、DMSO組、RES 50 mg/kg組、RES100 mg/kg組,每孔加入250μl單細胞懸液,300 g離心5 min后棄上清收集細胞。三種處理組首先加入50μl(1∶100)PD-L1抗體冰上避光孵育60 min,各管加入250μl PBS重懸,300 g離心5 min后棄上清,重復2次；加入50μl(1∶100)AlexaFluor?488山羊抗大鼠IgG抗體冰上避光孵育30 min,PBS洗滌2次；再加入50μl(1∶100)熒光單克隆抗體組合CD45-APC/Cy7、CD3-APC、NK1.1-PE、CD8-BV510、CD16/32；單標記組分別加入單個熒光抗體,空白對照組不加入任何抗體,混勻4℃避光60 min,各管加入250μl PBS重懸,300 g離心5 min后棄上清,重復2次；用300μl PBS重懸后上流式細胞儀分析不同組移植瘤組織中CD8+T(表型為CD3+CD8+)細胞、NK(表型為CD3-NK1.1+)和NKT(表型為CD3+NK1.1+)細胞百分比變化以及腫瘤細胞表面PD-L1表達量變化。

表1 PCR引物Tab.1 PCR primers

1.2.5.5 流式細胞術檢測移植瘤組織中髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)百分比變化 同上法制備各處理組小鼠移植瘤的單細胞懸液,三種處理組分別加入熒光標記的單克隆抗體組合CD11b-FITC和Ly-6G/Ly-6C-PerCP Cy5.5(Ly-6G/Ly-6C即Gr1)并在冰上避光孵育,同時設置單標和空白對照,孵育結束后用PBS洗滌并重懸,最后用流式細胞儀分析不同組移植瘤組織中MDSCs(表型為CD11b+Gr1+)百分比變化。

1.2.5.6 流式細胞術檢測移植瘤組織中調節性T細胞(regulatory T cells,Tregs)細胞百分比變化 同上法制備各處理組小鼠移植瘤的單細胞懸液,各組分別加入熒光標記的單克隆抗體組合CD4-FITC和CD25-APC,混勻4℃避光60 min；各管加入250μl PBS重懸,300 g離心5 min后棄上清,重復2次；加入1×固定/穿膜液100μl,4℃避光孵育30 min,加入250μl 1×洗滌緩沖液300 g離心5 min,洗滌2次,棄上清液；每孔加入固定/穿膜液配置的(1∶100)Foxp3-PE抗體50μl,4℃避光孵育60 min,加入250μl 1×洗滌緩沖液300×g離心5 min,洗滌2次,各管加入300μl PBS重懸。同時設置各種熒光抗體單標對照及空白對照,最后上流式細胞儀分析不同組移植瘤組織中Treg細胞(表型為CD25+CD4+Foxp3+)百分比變化。

1.3 統計學分析 采用GraphPad Prism 6.02軟件,運用獨立樣本雙尾t檢驗進行數據分析。所有數據均用表示。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RES對荷骨肉瘤小鼠移植瘤生長的影響及藥物毒副作用的測定 如圖1A所示,RES注射用藥16 d后,與DMSO組相比較,50 mg/kg及100 mg/kg兩個處理組的小鼠腫瘤體積顯著減小(P＜0.05,P＜0.01),表明50 mg/kg及100 mg/kg的RES均能顯著抑制小鼠K7M2移植瘤生長。另外,HE染色結果顯示,50 mg/kg及100 mg/kg RES處理組小鼠肝腎組織與DMSO組無顯著結構性差異,說明50 mg/kg及100 mg/kg RES并無明顯藥物毒性。

2.2 RES在體內外對骨肉瘤細胞表面PD-L1表達量的影響 如圖1B、C所示,與DMSO組相比較,RES 20μmol/L處理組PD-L1表達無顯著變化(NS),而RES 40μmol/L處理組PD-L1表達顯著增高(P＜0.001)。與體外結果相反,在體內實驗中(如圖1D、E),與DMSO組相比較,RES 100 mg/kg組PD-L1表達顯著降低(P＜0.05)。

2.3 RES在體內對與骨肉瘤細胞凋亡和細胞周期相關的基因和蛋白表達量的影響 如圖2所示,用RT-qPCR和Western blot檢測mRNA和蛋白表達發現,與DMSO組相比較,RES 100 mg/kg處理組Xiap、Kras、Mcl-1、Bcl-2和CylclinE1 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(均P＜0.05),而BAX mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(均P＜0.05)。

圖1 RES對體內外腫瘤細胞PD-L1表達及荷骨肉瘤小鼠移植瘤生長的影響Fig.1 Effect of RES on expression of PD-L1 on osteosarcoma cells and growth of transplanted osteosarcoma

2.4 RES對移植瘤組織中CD8+T細胞、NK和NKT細胞比例的影響 RES注射用藥16 d后,與DMSO組相比較,50 mg/kg及100 mg/kg兩處理組的小鼠移植瘤組織中CD8+T細胞百分比均顯著增多(P＜0.01,P＜0.001,圖3A、B)；NK細胞百分比均顯著增多(P＜0.001,P＜0.001,圖3C、D)；NKT細胞百分比亦顯著增多(P＜0.01,P＜0.05,圖3C、D)。說明RES處理能募集更多的抗腫瘤的免疫細胞浸潤到腫瘤中,調節腫瘤免疫微環境,增強機體抗腫瘤能力。

圖2 RES體內處理對腫瘤細胞凋亡和細胞周期相關的基因和蛋白表達量的影響Fig.2 Effect of RES on expression of mRNAs and proteins involved in apoptosis and cell cycle in tumor cells

圖3 RES對移植瘤組織中浸潤的免疫細胞比例的影響Fig.3 Effect of RES on percentage of immune cells infiltrated in transplanted tumor tissues

2.5 RES對腫瘤組織中MDSCs比例的影響 如圖3E、F所示,RES注射用藥16 d后,與DMSO組相比較,50 mg/kg及100 mg/kg兩個處理組的小鼠腫瘤組織中MDSCs百分比顯著減少(P＜0.05,P＜0.001),說明RES能改善荷骨肉瘤小鼠移植瘤組織中的腫瘤微環境,通過減少具有顯著抑制免疫應答能力的MDSCs的浸潤來增強免疫作用。

2.6 RES對腫瘤組織中調節性T細胞比例的影響如圖3G、H所示,RES注射用藥16 d后,與DMSO組相比較,50 mg/kg及100 mg/kg兩個處理組的小鼠腫瘤組織中調節性T細胞顯著減少(P＜0.01,P＜0.01),說明RES可以減少發揮免疫抑制性作用的調節性T細胞的浸潤,解除對其他免疫細胞的抑制作用,增強抗腫瘤免疫。

3 討論

骨肉瘤是一種惡性程度極高的骨腫瘤,是最常見于兒童的三種腫瘤之一,其中全世界15歲以下患有骨肉瘤的患者約有5萬例[9-10]。骨肉瘤患者通常采用化療和手術聯合的方式進行治療。對于非轉移性骨肉瘤而言,接受術后輔助化療,其5年生存率為60%～70%[11]。但骨肉瘤的治療還是面臨著復發和化療耐藥的巨大挑戰,腫瘤復發的患者中80%存在腫瘤轉移,這些患者的5年生存率僅為15%～30%[12-15]。因此,骨肉瘤迫切需要新的治療策略。

免疫治療近年發展迅速,通過免疫方式來對抗腫瘤已經展現出巨大的潛力[16-17]。在79%的尤文肉瘤中也觀察到完全或部分缺乏MHCⅠ類分子表達,反映其免疫逃逸機制的存在。而基于腫瘤反應性的T細胞或NK細胞的免疫治療策略也可以改善晚期尤文肉瘤的治療效果[18]。RES同樣展現具有免疫調節作用的潛力,除了上述所提到其增強腎細胞癌免疫原性的作用外[5],在本課題組前期的研究中也發現RES在顯著抑制體外骨肉瘤K7M2細胞系增殖的同時,能顯著增強體內外骨肉瘤K7M2細胞的MHC分子的表達[8]。本研究中通過構建荷骨肉瘤K7M2小鼠移植瘤模型,首先發現RES在50 mg/kg和100 mg/kg兩個劑量連續注射16 d能夠顯著抑制荷骨肉瘤小鼠移植瘤生長,進而對這種抑制效應的分子和免疫機制進行了探索。在體內實驗中,骨肉瘤細胞中與細胞凋亡和周期相關的基因和蛋白的表達在RES注射給藥后,同樣發生了改變。發揮抑制凋亡作用的X連鎖凋亡抑制蛋白(Xlinked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)[19],在腫瘤的發生發展中起作用的Kras以及Bcl-2家族中發揮抗凋亡作用的Bcl-2和Mcl-1 mRNA和蛋白表達均下調,Bcl-2家族中起促凋亡作用的BAX mRNA和蛋白表達則升高[20-21]；另外,在大多數人類腫瘤中過表達并與腫瘤發生相關的CyclinE1 mRNA和蛋白表達也同樣顯著降低[22]。這些結果表明RES處理后誘導腫瘤細胞凋亡發生和細胞周期的變化在小鼠移植瘤的生長抑制效應中同樣發揮重要作用。而在探索腫瘤細胞免疫原性改變方面,除了之前研究中發現的MHC分子的表達變化之外[8],本課題組在體內外對腫瘤細胞表面PD-L1的表達也進行了檢測。但需要注意的是,整個研究中有兩處出現了體內和體外結果表達不一致,其一就是RES體外處理后,K7M2細胞表面PD-L1的表達變化不明顯甚至出現表達升高,而體內用藥后,腫瘤細胞表面PD-L1表達明顯下降。實際上,腫瘤細胞表面表達的PD-L1通過與活化T細胞表面的PD-1受體結合而發揮免疫抑制作用[23],而單純在體外細胞實驗PD-L1這種免疫效應難以產生,而出現此種表達變化差異；另外一處則是CyclinE1蛋白表達在體外檢測為顯著升高,而在體內給藥后,腫瘤細胞CyclinE1蛋白表達顯著降低,活體動物具有更復雜的分子調控機制,同樣,完善的免疫系統所發揮的效應也是細胞實驗所無法模擬的；免疫抗腫瘤效應在體內增強也可能影響信號分子表達的變化。總之,雖然PDL1和CylinE1體內外表達結果不相同,但本研究的體內外實驗中都觀察到了腫瘤細胞顯著的生長抑制效應。而到底是何種機制導致上述表達變化的差異將是我們未來的研究內容,如在各自機制中影響體內體外表達的可能因素,如其他周期蛋白的表達變化,亦或是免疫機制和分子機制之間的相互作用影響。

RES具有改變腫瘤細胞免疫原性的潛力[5,8],因此課題組通過流式檢測了移植瘤組織中免疫細胞的數量變化,發現較DMSO組小鼠而言,50 mg/kg和100 mg/kg RES組的小鼠移植瘤組織中CD8+T、NK和NKT細胞數量顯著增多,而MDSCs和調節性T細胞數量顯著減少。CD8+T細胞可以識別腫瘤細胞表面表達增強的MHCⅠ類分子抗原肽復合物,CD8+T細胞、NKT和NK細胞參與攻擊腫瘤細胞,在抑制腫瘤增殖中發揮重要的作用[24]。在腫瘤發展過程中,具有CD4+CD25+Foxp3+表型的調節性T細胞以及有類似作用的MDSCs等免疫細胞可以共同拮抗保護性的免疫反應,加速腫瘤進展[25-26]。而本研究的結果表明,RES顯著減少了腫瘤組織中的調節性T細胞和MDSCs浸潤,可逆轉這些免疫細胞對骨肉瘤的免疫抑制作用。這些變化與增加的CD8+T細胞、NK-T細胞和NK細胞共同作用,改善腫瘤免疫微環境,抑制了移植瘤的生長。

需要強調的是,本研究動物實驗部分并未設置陽性對照組,主要原因是RES作用于骨肉瘤細胞生長抑制作用已得到廣泛研究[27-29],而前期也并未查詢到調節荷骨肉瘤小鼠移植瘤免疫細胞的藥物。缺乏陽性對照組無法比較與目前臨床用藥的藥效強度,同時,實驗也可能出現假陽性。此研究再次驗證其他報道中RES對體內外骨肉瘤細胞生長抑制作用,而對免疫調節作用進行的是初步的探索,因為缺少陽性對照組可能出現的影響主要通過合理的實驗操作和檢測方法來規避。

綜上所述,RES能抑制荷骨肉瘤K7M2小鼠移植瘤生長,這也與既往報道的RES體外抗K7M2細胞系增殖結論相一致[8]。RES能調控與細胞凋亡和細胞周期相關基因及蛋白表達；并且,RES能顯著增強腫瘤細胞免疫原性,調控多種免疫細胞參與抗腫瘤,即抗腫瘤免疫細胞比例顯著增多,而抑制性免疫細胞浸潤顯著減少；兩種機制共同發揮作用,達到抑制腫瘤細胞生長的效應。總之,本研究結果提示,RES對骨肉瘤細胞具有生長抑制和免疫調節作用,值得繼續深入研究探索。