LINC00355調(diào)控miR-494-3p/CCND2對前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響①

張建育 李毅寧 郭一泓 穆 鑫 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科泉州362000

前列腺癌是臨床常見惡性腫瘤之一,其發(fā)病率逐年升高,但前列腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未闡明[1]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)在多種腫瘤中異常表達(dá)并可影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化等過程[2]。研究表明LncRNA表達(dá)異常與前列腺癌發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[3]。但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明。長鏈非編碼RNA(LncRNA LINC00355)在腫瘤中呈高表達(dá)并可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[4]。微小RNA-494-3p(microRNA-494-3p,miR-494-3p)在髓母細(xì)胞瘤中呈低表達(dá),上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤進(jìn)展[5]。細(xì)胞周期蛋白HD2(cyclin-D2,CCND2)在卵巢癌中表達(dá)量升高,下調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲[6]。生物學(xué)信息學(xué)分析顯示LINC00355與miR-494-3p存在結(jié)合位點(diǎn),miR-494-3p與CCND2存在結(jié)合位點(diǎn),但LINC00355是否可通過調(diào)控miR-494-3p/CCND2參與前列腺癌發(fā)生及發(fā)展過程尚未可知。本研究主要探討前列腺癌組織中LINC00355、miR-494-3p、CCND2的表達(dá),探究LINC00355對前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響,分析其對miR-494-3p、CCND2的調(diào)控作用,旨在為揭示前列腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 前列腺癌細(xì)胞DU145購自美國ATCC細(xì)胞庫；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000與TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄與qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；LINC00355小干擾RNA(si-LINC00355)(序列:ACGAUCUAUCGAUCGUAG)、亂序無意義陰性對照(si-NC)、miR-494-3p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-494-3p)(序列:GUUUGUUUUCACUAGUCUAGC)及其陰性對照(anti-miR-NC)、miR-494-3p寡核苷酸模擬物(miR-494-3p mimics)(序列:AGUCGAUCUACGUAGCUAGUCG)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)、膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；兔抗人P21、上皮鈣黏附素(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)抗體購自美國CST公司；兔抗人CCND2抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.1.2 前列腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本來源 收集2017年2月至2018年12月本院收治的36例前列腺癌患者為研究對象,所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為前列腺癌,年齡50～65歲,平均年齡(55.49±6.57)歲,術(shù)中切除前列腺癌組織及癌旁組織,置于-80℃超低溫冰箱保存。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者知情且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 前列腺癌細(xì)胞DU145培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)期DU145細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化,制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml,接種于24孔板(100μl/孔),待細(xì)胞生長融合至70%時參照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分別將si-NC、si-LINC00355、si-LINC00355與anti-miR-NC、si-LINC00355與antimiR-494-3p、si-LINC00355與miR-NC、si-LINC00355與miR-494-3p mimics共轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞,分別記作si-NC組、si-LINC00355組、si-LINC00355+antimiR-NC組、si-LINC00355+anti-miR-494-3p組、si-LINC00355+miR-NC組、si-LINC00355+miR-494-3p組。轉(zhuǎn)染前2 h更換為不含血清的培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。

1.2.2 qRT-PCR檢測LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA的表達(dá)水平 采用TRIzol法提取前列腺癌組織、癌旁組織及各組DU145細(xì)胞中的總RNA,Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA。LINC00355 F:5′-GTCTTGCTTTGTCACCCAGG-3′,R:5′-CTAACACTTTGGGCAGCGTT-3′；miR-494-3p F:5′-CTTCGGCAGCACATATACTAAA-3′,R:5′-TCGACTAGTCCAGCATGTCA-3′；CCND2 F:5′-ACTTGTGATGCCCTGACTGA-3′,R:5′-AAGTTGGGCACAGGTCGATA-3′；U6 F:5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′,R:5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；GAPDH F:5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′,R:5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′,引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。按照RT-PCR試劑盒配置反應(yīng)體系,置于ABI 7500型熒光定量PCR儀中檢測,反應(yīng)條件:95℃2 min,95℃30 s,60℃30 s,72℃30 s,共40次循環(huán)。LINC00355與CCND2以GAPDH為內(nèi)參,miR-494-3p以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA相對表達(dá)。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖 收集各組對數(shù)期DU145細(xì)胞接種于96孔板(5×104個/孔),每組設(shè)置3個復(fù)孔,轉(zhuǎn)染48 h時,每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/ml的MTT溶液20μl,37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h,1 300 r/min離心5 min,棄上清,加入150μl DMSO,室溫振蕩孵育5 min,酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(490 nm),計算細(xì)胞增殖抑制率(%),細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移與侵襲 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):收集各組對數(shù)期DU145細(xì)胞接種于24孔板Transwell小室的上室(5×104個/孔),Transwell小室的下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液(600μl/孔),37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,棄上清液,PBS洗滌,多聚甲醛固定20 min,PBS洗滌,加入0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min,棉簽擦拭未遷移的細(xì)胞,顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):預(yù)冷培養(yǎng)液按照9∶1的比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠,加入24孔板Transwell小室的上室(40μl/孔),37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h,后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測LINC00355靶向miR-494-3p及miR-494-3p靶向CCND2 starBase預(yù)測顯示LINC00355與miR-494-3p存在結(jié)合位點(diǎn),CCND2的3′UTR含有miR-494-3p的互補(bǔ)序列,采用基因定點(diǎn)突變技術(shù)突變結(jié)合位點(diǎn),分別將含有結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)的片段克隆至pmirGLO載體得到野生型載體WT-LINC00355、突變型載體MUTLINC00355、野生型載體WT-CCND2、突變型載體MUT-CCND2,分別將 WT-LINC00355、MUTLINC00355、WT-CCND2、MUT-CCND2與miR-NC、miR-494-3p mimics共轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞,檢測細(xì)胞相對熒光素酶活性。

1.2.6 Western blot檢測CCND2、P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá) 收集各組對數(shù)期DU145細(xì)胞,采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白并檢測蛋白濃度。采用SDS-PAGE分離蛋白,分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,加入蛋白一抗(1∶1 000),4℃孵育24 h,TBST洗滌,加入二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h,TBST洗滌,加入ECL,暗室內(nèi)曝光顯影,應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計量資料以表示且均符合正態(tài)分布,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00355、miR-494-3p、CCND2在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 與癌旁組織相比,前列腺癌組織中LINC00355與CCND2 mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05),miR-494-3p的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05),見表1。

2.2 抑制LINC00355對DU145細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與si-NC組相比,si-LINC00355組LINC00355的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05),細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P＜0.05),遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.05),P21、E-cadherin蛋白水平顯著升高(P＜0.05),MMP-2蛋白水平顯著降低(P＜0.05),見圖1、表2。

表1 LINC00355、miR-494-3p、CCND2在癌旁組織和前列腺癌組織中的表達(dá)(，n=36)Tab.1 Expression of LINC00355，miR-494-3p，CCND2 in adjacent tissues and prostate cancer tissue(，n=36)

表1 LINC00355、miR-494-3p、CCND2在癌旁組織和前列腺癌組織中的表達(dá)(，n=36)Tab.1 Expression of LINC00355，miR-494-3p，CCND2 in adjacent tissues and prostate cancer tissue(，n=36)

Note:Compared with adjacent tissues,1)P＜0.001.

Groups LINC00355 miR-494-3p CCND2 mRNA Adjacent tissues 1.00±0.06 0.98±0.04 1.01±0.06 Prostate cancer tissue 2.37±0.081) 0.28±0.031) 2.14±0.071)t 82.000 84.000 73.539 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 抑制LINC00355對DU145細(xì)胞中miR-494-3p、CCND2表達(dá)的影響 與si-NC組相比,si-LINC00355組細(xì)胞中miR-494-3p的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05),CCND2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05),見圖2、表3。

2.4 抑制miR-494-3p能減輕抑制LINC00355對DU145細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與si-LINC00355+anti-miR-NC組相比,si-LINC00355+anti-miR-494-3p組miR-494-3p的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05),細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(P＜0.05),遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多(P＜0.05),P21、E-cadherin蛋白水平顯著降低(P＜0.05),MMP-2蛋白水平顯著升高(P＜0.05),見圖3、表4。

圖1 抑制LINC00355對DU145細(xì)胞中P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of inhibition of LINC00355 on expressions of P21， E-cadherin and MMP-2 protein in DU145 cells

圖2 CCND2蛋白的表達(dá)Fig.2 Protein expression of CCND2

表2 抑制LINC00355對DU145細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響(，n=9)Tab.2 Effect of inhibition LINC00355 on proliferation，migration and invasion of DU145 cells(，n=9)

表2 抑制LINC00355對DU145細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響(，n=9)Tab.2 Effect of inhibition LINC00355 on proliferation，migration and invasion of DU145 cells(，n=9)

Note:Compared with si-NC group,1)P＜0.05.

Groups LINC00355 Inhibition rate(%)Number of migrating cells Number of invasion cells P21 E-cadherin MMP-2 si-NC 1.02±0.06 0.11±0.01 136.00±9.14 86.00±7.42 0.19±0.02 0.24±0.03 0.77±0.05 si-LINC00355 0.35±0.041) 52.26±3.031) 61.00±6.081) 38.00±4.291) 0.65±0.041) 0.76±0.041) 0.29±0.031)t 27.874 51.633 20.496 16.801 30.858 31.200 24.696 P＜0.001 ＜0.05 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.0 01

2.5 miR-494-3p過表達(dá)能增強(qiáng)抑制LINC00355對DU145細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與si-LINC00355+miR-NC組相比,si-LINC00355+miR-494-3p組miR-494-3p的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05),細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P＜0.05),遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.05),P21、Ecadherin蛋白水平顯著升高(P＜0.05),MMP-2蛋白水平顯著降低(P＜0.05),見圖4、表5。

表3 抑制LINC00355對細(xì)胞DU145中miR-494-3p、CCND2表達(dá)的影響(，n=9)Tab.3 Effect of inhibiting LINC00355 on expression of miR-494-3p and CCND2 in DU145 cells(，n=9)

表3 抑制LINC00355對細(xì)胞DU145中miR-494-3p、CCND2表達(dá)的影響(，n=9)Tab.3 Effect of inhibiting LINC00355 on expression of miR-494-3p and CCND2 in DU145 cells(，n=9)

Note:Compared with si-NC group,1)P＜0.001.

Groups miR-494-3p CCND2 mRNA CCND2 protein si-NC 0.98±0.07 1.00±0.05 0.87±0.06 si-LINC00355 1.71±0.091) 0.31±0.031) 0.42±0.041)t 19.208 35.500 18.721 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖3 P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of P21，E-cadherin，MMP-2 protein

2.6 LINC00355靶向miR-494-3p及miR-494-3p靶向CCND2 starBase預(yù)測顯示LINC00355與miR-494-3p存在結(jié)合位點(diǎn),miR-494-3p與CCND2存在結(jié)合位點(diǎn),見圖5A、B。雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染野生型載體WT-LINC00355的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,miR-494-3p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-LINC00355的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,miR-494-3p組熒光素酶活性與miR-NC組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；轉(zhuǎn)染野生型載體WT-CCND2的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,miR-494-3p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-CCND2的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,miR-494-3p組熒光素酶活性與miR-NC組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),見表6。與pcDNA3.1組相比,pcDNA 3.1-LINC00355組細(xì)胞中 miR-494-3p的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05),見表7。與miR-NC組相比,miR-494-3p組細(xì)胞中CCND2 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)；與anti-miR-NC組相比,anti-miR-494-3p組細(xì)胞中CCND2 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05),見圖5C、表8。

圖4 P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表達(dá)Fig.4 Expressions of P21，E-cadherin，MMP-2 protein

表4 抑制miR-494-3p能減輕抑制LINC00355對DU145細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響(，n=9)Tab.4 Inhibition of miR-494-3p could reduce inhibitory effect of LINC00355 on proliferation，migration and invasion of DU145 cells(n=9)

表4 抑制miR-494-3p能減輕抑制LINC00355對DU145細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響(，n=9)Tab.4 Inhibition of miR-494-3p could reduce inhibitory effect of LINC00355 on proliferation，migration and invasion of DU145 cells(n=9)

Note:Compared with si-LINC00355+anti-miR-NC group,1)P＜0.001.

Groups miR-494-3p CCND2 Inhibition rate(%)Number of migrating cells Number of invasion cells P21 E-cadherin MMP-2 8±0.04 0.28±0.03 si-LINC00355+anti-miR-494-3p 0.26±0.031)0.78±0.051)18.04±2.011)120±7.881) 71±5.671) 0.25±0.031)0.30±0.031)0.60±0.041)t 37.044 17.493 26.703 17.044 14.492 25.200 28.800 19.200 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.si-LINC00355+anti-miR-NC 0.98±0.05 0.44±0.03 52.35±3.42 63±6.21 37±4.17 0.67±0.04 0.7 001 ＜0.001

表5 miR-494-3p能增強(qiáng)抑制LINC00355對細(xì)胞DU145增殖、遷移、侵襲的影響(，n=9)Tab.5 miR-494-3p could enhance inhibitory effect of LINC00355 on proliferation，migration and invasion of cell DU145(，n=9)

表5 miR-494-3p能增強(qiáng)抑制LINC00355對細(xì)胞DU145增殖、遷移、侵襲的影響(，n=9)Tab.5 miR-494-3p could enhance inhibitory effect of LINC00355 on proliferation，migration and invasion of cell DU145(，n=9)

Note:Compared with si-LINC00355+miR-NCgroup,1)P＜0.001.

Groups miR-494-3p CCND2 Inhibition rate(%)Number of migrating cells Number of invasion cells P21 E-cadherin MMP-2 5 0.30±0.03 si-LINC00355+miR-494-3p 1.68±0.081)0.15±0.021)77.19±4.231) 40±3.581) 24±2.361) 0.92±0.051)1.03±0.061)0.12±0.021)t 20.700 23.297 13.600 11.683 10.434 12.182 9.987 14.977 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.si-LINC00355+miR-NC 0.99±0.06 0.43±0.03 51.98±3.61 62±4.37 39±3.61 0.66±0.04 0.77±0.0 001 ＜0.001

圖5 LINC00355、miR-494-3p、CCND2之間的靶向關(guān)系Fig.5 Targeting relationship between LINC00355，miR-494-3p，CCND2

表6 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)(，n=9)Tab.6 Dual luciferase reporter experiment(，n=9)

表6 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)(，n=9)Tab.6 Dual luciferase reporter experiment(，n=9)

Note:Compared with miR-NC group,1)P＜0.001.

Groups WTLINC00355 MUTLINC00355 WTCCND2 MUTCCND2 miR-NC 0.93±0.06 0.94±0.06 1.01±0.05 0.99±0.06 miR-494-3p 0.35±0.041)0.97±0.06 0.28±0.031)0.97±0.06 t 24.130 1.061 37.558 0.707 P ＜0.001 0.305 ＜0.001 0.489

表7 LINC00355調(diào)控miR-494-3p的表達(dá)(n=9)Tab.7 LINC00355 regulated expression of miR-494-3p(，n=9)

表7 LINC00355調(diào)控miR-494-3p的表達(dá)(n=9)Tab.7 LINC00355 regulated expression of miR-494-3p(，n=9)

Note:Compared with pcDNA3.1 group,1)P＜0.001.

Groups miR-494-3p pcDNA3.1 0.96±0.06 pcDNA3.1-LINC00355 0.38±0.041)t 24.130 P ＜0.001

表8 miR-494-3p調(diào)控CCND2的表達(dá)(，n=9)Tab.8 miR-494-3p regulated expression of CCND2(，n=9)

表8 miR-494-3p調(diào)控CCND2的表達(dá)(，n=9)Tab.8 miR-494-3p regulated expression of CCND2(，n=9)

Note:Compared with miR-NC group,1)P＜0.001；compared with antimiR-NC group,2)P＜0.001.

Groups CCND2 mRNA CCND2 protein miR-NC 0.98±0.06 0.80±0.04 miR-494-3p 0.27±0.031) 0.33±0.031)anti-miR-NC 0.96±0.06 0.81±0.04 anti-miR-494-3p 1.66±0.082) 1.23±0.062)F 632.221 621.337 P ＜0.001 ＜0.001

3 討論

前列腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)可降低治療效果及影響患者生活質(zhì)量,研究表明LncRNA在前列腺癌組織或細(xì)胞中表達(dá)升高或降低,并可通過影響前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲從而發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[7-9]。但仍有部分LncRNA在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。

LINC00355在膀胱癌、肺腺癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào),并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲,還可作為臨床診斷指標(biāo)[10-12]。與上述研究結(jié)果相似,本研究結(jié)果顯示LINC00355在前列腺癌組織中呈高表達(dá),抑制其表達(dá)可明顯降低前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。提示LINC00355在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮癌基因的作用,抑制LINC00355表達(dá)可減弱前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。研究表明P21可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞增殖[13]。相關(guān)報道指出上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān),其中E-cadherin是EMT上皮表型標(biāo)志物,其表達(dá)量降低可促進(jìn)EMT的發(fā)生進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲。MMP-2屬于基質(zhì)金屬蛋白酶類,可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積從而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]。本研究結(jié)果顯示抑制LINC00355表達(dá)后,前列腺癌細(xì)胞中P21、E-cadherin表達(dá)量升高,MMP-2表達(dá)量降低,提示抑制LINC00355表達(dá)可能通過上調(diào)P21、E-cadherin表達(dá)及下調(diào)MMP-2表達(dá)從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

miR-494-3p表達(dá)量降低可促進(jìn)肝細(xì)胞癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及發(fā)展[15-16]。本研究結(jié)果顯示miR-494-3p在前列腺癌組織中表達(dá)量降低,進(jìn)一步研究顯示抑制miR-494-3p表達(dá)可明顯促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,說明抑制miR-494-3p表達(dá)可減弱抑制LINC00355對DU145細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響。同時,miR-494-3p過表達(dá)可明顯降低前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力,說明miR-494-3p過表達(dá)可增強(qiáng)抑制LINC00355對DU145細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響。提示LINC00355可能通過下調(diào)miR-494-3p表達(dá)從而促進(jìn)前列腺癌發(fā)生及發(fā)展。研究表明LncRNA H19與CCND2競爭性結(jié)合miR-29c-3p從而促進(jìn)膀胱癌發(fā)生及發(fā)展[17]。相關(guān)報道指出CCND2在宮頸癌中表達(dá)量升高,并可促進(jìn)宮頸癌發(fā)生及發(fā)展[18]。本研究結(jié)果顯示CCND2在前列腺癌組織中表達(dá)量升高,與上述研究結(jié)果相似,提示CCND2在前列腺癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮癌基因作用。本研究結(jié)果顯示前列腺癌細(xì)胞中抑制LINC00355表達(dá)后可明顯促進(jìn)miR-494-3p表達(dá)、抑制CCND2表達(dá),提示抑制LINC00355表達(dá)可能通過調(diào)控miR-494-3p/CCND2分子軸從而發(fā)揮作用。同時本研究結(jié)果證實(shí)LINC00355可靶向結(jié)合miR-494-3p,miR-494-3p可靶向結(jié)合CCND2,LINC00355可負(fù)向調(diào)控miR-494-3p的表達(dá),miR-494-3p可負(fù)向調(diào)控CCND2的表達(dá),提示LINC00355可作為競爭性內(nèi)源RNA而抑制miR-494-3p表達(dá)從而間接上調(diào)CCND2的表達(dá)。

綜上所述,LINC00355與CCND2在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中可作為癌基因,二者可競爭性結(jié)合miR-494-3p從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,LINC00355可能作為前列腺癌靶向治療的潛在靶點(diǎn),并為臨床前列腺癌的診斷及治療提供新方向。