羧基化聚苯乙烯微球與血型糖蛋白偶聯及其對血型抗體吸收/釋放的效應①

余忠清 田鑫華 陳 慶 余靜薇 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院輸血科武漢430022

新生兒溶血病(hemolytic disease of new born,HDN)是指母嬰ABO/Rh血型不合,多次妊娠導致母體血液中產生高效價IgG類血型抗體的疾病。IgG抗體可穿過胎盤屏障進入胎兒血液循環,并引起胎兒或新生兒同種免疫反應性溶血性貧血、黃疸、水腫、肝脾腫大,甚至導致膽紅素性腦病,引起胎兒或新生兒大腦基底核、視丘下核、蒼白球等部位病變,導致胎兒或新生兒智力低下[1]。我國ABOHDN占85%,Rh HDN占14.9%,其他血型系統HDN僅占0.1%[2]。臨床常采用孕婦IgG抗體效價監測我國不同種族人群ABO HDN發病率,對ABO HDN進行早期診斷與治療。當IgG抗A或抗B效價＞64時,常采用茵陳利濕退黃,當IgG抗A或B效價＞256且持續升高者,另外給予血漿置換或免疫球蛋白注射治療,以去除IgG或封閉IgG Fc受體,防治孕婦早期自然流產或中晚期死胎[3-4]。以上療法各有優點,但同時也存在諸多不足。如茵陳僅有排泄黃疸作用,但無法降低IgG抗A或抗B含量,血漿置換可降低IgG抗A或抗B含量,使胎兒紅細胞免受血型抗體破壞,可阻斷不完全抗體與Fc受體結合,防止HDN發生,但二者同時存在感染乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)、梅毒的潛在風險,且血漿置換用量大,治療周期長,易導致血漿資源短缺和孕婦血漿資源丟失與浪費。本研究將血型糖蛋白與羧基化聚苯乙烯微球(carboxyzed polystyrene microspheres,CPM)進行偶聯,并進行CLC吸收/釋放相關研究,研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 CPM由上海羧菲生物有限責任公司代理合成；羧基活化劑1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)購自上海邁瑞爾生物科技有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自上海阿拉丁生物科技有限責任公司；pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)在實驗前臨時按試劑說明書配制；超純蒸餾水由外科實驗室自制。熒光標記的山單克隆抗體購自長春生物試劑有限公司；熒光標記的山羊抗小鼠二抗購自Servicebio公司。

1.1.2 儀器 低溫真空冷干機(Heto Lab Equipment,美國科學儀器廠)；超速離心機(美國Thermo)；Thermo酶標儀(Multiskan Go,美國Thermo)；傅立葉變換紅外光譜儀(INVENIOR型,德國布魯克)；熒光顯微鏡(OLYMPUS IX71,日本OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 血型糖蛋白提取 取A、B血型健康志愿者(均來自我院)唾液各50 ml,3 580 g 5 min,取上清加熱煮沸15 min破壞唾液酸及蛋白,再次離心10 min,取上清分裝于10 ml試管,-80℃速凍24 h,低溫真空抽干機中12 h過夜抽干,得到可溶性血型糖蛋白干燥粉劑保存備用。

1.2.2 CPM檢測 取少量CPM生理鹽水洗滌3次,加入KBr晶體混合壓片,紅外光譜儀掃描,數據歸一化處理。

1.2.3 CPM活化 分別稱取EDC 16 mg、NHS 24 mg、超純水40 ml于50 ml試管中,漩渦狀態下溶解。取CPM 4 ml(25 mg/ml)分散至EDC/NHS溶液中,室溫反應30 min～2 h,分裝于標記EP管,A、B各15支,8 100 g離心5 min去上清。

1.2.4 CPM偶聯 取A、B血型糖蛋白粉劑各6 mg分別溶于2 ml pH7.2 PBS緩沖溶液中,取A、B血型糖蛋白溶液125μl,快速加入1.2.3盛裝CPM的EP管中,混勻,反應12 h,A、B血型糖蛋白與CPM自動縮合形成CLC。偶聯率=(偶聯前蛋白含量-偶聯后蛋白含量)/偶聯前蛋白含量×100%。

1.2.5 CLC熒光檢測 取A、B血型CLC重懸于0.2 ml PBS中,分裝至A、B 2管。加入等體積單克隆抗A和抗B抗體,4℃搖動24 h,5 595 g離心5 min,去上清。加入200μl PBS重懸沉淀,分別加入熒光標記的山羊抗小鼠二抗IgG 5μl,37℃孵育30 min,5 595 g離心5 min,去上清。取100μl PBS重懸沉淀,加入適量CLC于載玻片上,熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 CLC免疫功能檢測

1.2.6.1 吸收試驗 取CLC偶聯產品5 595 g離心2 min去上清,生理鹽水洗滌3次,末次吸干管壁水分,加入效價1∶256或1∶512的單克隆IgM抗A/抗B 60μl,在室溫吸收15 min,5 595 g離心5 min。取上清45μl,生理鹽水1∶2、1∶4…1∶1 024稀釋,加入2%A和B試劑紅細胞45μl反應5 min,2 587 g離心1 min,觀察紅細胞凝集狀態,對比分析吸收前后IgM抗A/抗B效價變化,并統計數據[5]。

1.2.6.2 放散試驗 取1.2.6.1吸收IgM抗A和抗B的CLC試管各2支,生理鹽水洗3次后,吸干管壁水分,加入生理鹽水60μl重懸,56℃水浴放散5 min,5 595 g離心1 min,快速取放散液45μl,加入對應試劑紅細胞反應1 min,2 587 g離心10 s,光學顯微鏡觀察紅細胞凝集狀態[5]。

1.2.6.3 IgG抗體效價 選取產前檢查的孕婦IgG抗A/抗B效價＞128血漿樣本,抗A 15份,抗B 15份。對應加入盛裝A、B血型CLC試管中,封口,37℃吸收30 min,5 595 g離心5 min,每份取上清45μl 1∶2、1∶4…1∶2 048稀釋,每份取稀釋液25μl加入微柱孔,加入2%試劑紅細胞25μl微柱孔中,混勻,37℃孵育15 min,895 g離心10 min,以凝集反應陽性為(+)最高稀釋倍為IgG抗體效價,對比分析吸收前后效價變化。Rh抗D和自身抗體吸收方法同上。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析,數據以表示,采用t檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CPM紅外線光譜檢測 CPM成品經紅外線光譜掃描,在3 442 cm-1處出現明顯吸收峰,為-OH伸縮振動形成,1 728～1 630 cm-1處出現1個較長振動峰值,此峰波為-COOH特征峰波,見圖1。

2.2 血型糖蛋白偶聯率 已知含量血型糖蛋白與偶聯后血型糖蛋白含量之差,計算血型糖蛋白偶聯率,A、B血型糖蛋白偶聯率分別為53.45%和61.60%。

圖1 CPM紅外光譜掃描Fig.1 CPM infrared spectrum scanning

2.3 CLC熒光檢測 CLC吸附單克隆抗體后與熒光標記二抗IgG結合,暗視野顯微鏡下,A血型CLC呈藍綠色熒光,B血型CLC呈紅色免疫熒光,見圖2。

2.4 吸收試驗 已知效價1:256和1:512單克隆抗體經CLC吸收后,IgM抗A平均由477.87下降至55.47,抗B由460.80下降至53.33,見圖3。

圖2 A、B血型CLC免疫熒光結果Fig.2 Immunofluorescence result of CLC of blood group A and B

圖3 吸收前后單克隆抗體效價變化Fig.3 Monoclonal antibody titer changes before and after absorption

圖4 試劑紅細胞凝集反應Fig.4 Agglutination reaction of reagent red blood cells

圖5 吸收前后IgG抗A、抗B效價變化Fig.5 Changes of IgG anti-A，anti-B titer before and after absorption

2.5 放散試驗 吸收IgM抗A、抗B的CLCA和B試劑出現紅細胞凝集反應(3+),見圖4。

2.6 IgG抗A效價 15份血樣IgG抗A經CLC吸收后平均由750.90降至115.20。IgG抗B經CLC吸收后平均由537.60降至99.60,見圖5。

2.7 Rh抗D及自身抗體監測 CLC與單克隆Rh抗D及自身抗體定性監測結果顯示二者均不被吸收。

3 討論

以偶氮二異丁腈(AIBN)為引發劑,將苯乙烯單分散聚合為苯乙烯微球,采用種子苯乙烯微球與帶羧基官能團單體共聚合可制備CPM[6-8]。CPM羧基主要以2種方式存在于微球中,一種由共聚合反應埋沒顆粒內部,即包埋酸,另一種由聚合反應結合微球表面,即表面酸[8]。包埋酸與表面酸,酸根均為即-COOH,-COOH經紅外光譜掃描,在3 442 cm-1處明顯吸收峰,為-OH伸縮振動形成,在1 728～1 630 cm-1處顯較長的振動峰,為-COOH特征吸收峰,其峰值高度與-COOH數呈正相關。

血型糖蛋白是寡糖與多肽鏈共價連接的蛋白,其多肽鏈含有氨基(-NH2),廣泛存在于人體體液、黏液和唾液中[9]。收集健康志愿者唾液純化分離,可制備血型糖蛋白。血型糖蛋白可耐高熱,121℃高壓蒸汽滅菌,其生物活性和免疫原性不被破壞[10]。利用血型糖蛋白特性,使其與CPM偶聯,其偶聯發生機制為:①在EDC作用下,EDC首先和CMP表面-COOH偶聯,形成1個O-異?；蚪Y構且具有活性的中間產物,加入可溶性血型糖蛋白時,由于糖蛋白多肽鏈上存在游離-NH2,具有活性的中間產物受-NH2猛烈進攻并脫水縮合,形成酰胺鍵結合的CLC,通過酰胺鍵作用使血型糖蛋白牢固交聯于微球表面及內部而不易斷裂和脫落[11]；②偶聯過程中NHS形成更穩定的酯類增強EDC偶聯的穩定性。因此在偶聯過程中,EDC/NHS活化劑可使-COOH與-NH2脫水縮合,本身無膠原基質并轉變為水溶性脲衍生物,細胞毒性較小[11]。

酶標儀監測CLC偶聯前后血型糖蛋白含量,A血型糖蛋白含量偶聯前后由0.387 5±0.000 6降至0.180 8±0.000 7,B血型糖蛋白含量平均由0.387 4±0.000 3降至0.148 8±0.000 5,其偶聯率分別為53.45%和61.60%(P＜0.01),故偶聯前后A、B血型糖蛋白差異有統計學意義。暗視野顯微鏡下,CLC與熒光二抗結合后A血型CLC呈藍綠色熒光,B血型呈紅色熒光,提示血型糖蛋白與CPM發生偶聯[11]。CLC表面熒光越強,表明血型糖蛋白偶聯率越高。由CLC偶聯率分析評估可知,反應體系中尚存游離血型糖蛋白,經離心洗滌后被清除,得到純凈CLC進行免疫功能研究。

CLC吸收IgM抗體后,IgM抗A效價由477.87±87.02降至55.47±14.15,IgM抗B效價由460.80±102.40降至53.33±15.08(P＜0.01),吸收前后抗體效價差異有統計學意義,提示CLC是良好的免疫吸收劑。將吸附血型抗體CLC在56℃水浴中放散,IgM抗A和抗B可從CLC上釋放,與其對應的試劑紅細胞在鹽水介質中發生凝集反應(3+),紅細胞抗原與血型抗體結合可逆,但實驗研究表明,可溶性血型糖蛋白與血型抗體結合是不可逆的單向結合。本研究發現,可溶性血型糖蛋白與CPM脫水縮合,改變血型糖蛋白免疫功能,使其變為可逆性結合而具有臨床應用價值,既往文獻未見報道。CLC對IgG抗A和抗B其有良好的吸收作用,IgG抗A效價由750.90±412.40降至115.20±74.60(P＜0.01),IgG抗B效價由537.60±273.33降至99.60±59.96(P＜0.01),提示CLC可顯著降低血漿IgG抗體含量,為孕婦及胎兒ABO HDN治療和自身血液回輸奠定了理論和實踐基礎,是本課題創新之處,有望為臨床治療提供新方法。Rh抗D及自身抗體CLC均不被吸收,表明人體唾液中不含Rh類血型糖蛋白,從而可避免CLC與Rh系統交叉反應,也可避免自身冷/溫抗體交叉反應,故CLC僅對ABO抗體特異性吸收與釋放,在臨床疑難血型實驗診斷中具有重要意義。

綜上所述,可溶性血型糖蛋白可與CPM偶聯而形成CLC,有機分子間通過酰胺鍵結合改變可溶性血型糖蛋白免疫功能,具有實用價值。利用CLC可制備免疫吸附膜,降低血漿IgG抗A、B含量,對孕婦及胎兒ABO-HDN免疫吸附治療后可實施自身血液回輸,保護胎兒紅細胞免受IgG抗體破壞,既節約血液資源,又可替代中藥茵陳、血漿置換和丙種球蛋白注射治療而避免輸血后傳染病傳播。利用CLC吸附功能清除貯藏冰凍血漿和冷沉淀等血液成分中游離的IgM抗A、B吸附,制備“通用型”冷凍血漿貯藏制劑,用于緊急輸血和軍事、嚴重燒傷搶救和老弱病殘血漿蛋白補充,尤其是危重癥新冠肺炎和乙肝患者大量血漿置換及血友病冷沉淀輸血,可避免同型血漿資源短缺；利用CLC熱釋放功能,在自身抗體嚴重干擾ABO/Rh血型鑒定時,可從多種混合性抗體的血液中分離血型抗體,并用試劑紅細胞鑒定,既可用于鑒別診斷,又可為臨床安全輸血提供依據。因此CLC在臨床上用途廣泛,值得深入研究,以期為臨床開發新產品、提供治療新方法提供新途徑。