2型糖尿病患者外周血Th17/IL-17與牙周狀態和血糖控制的關系①

王 佳 李寶坤 魯 皓 李金鳳 陳曉濤 石河子大學醫學院石河子832000

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種涉及胰島素影響血糖穩定的代謝性疾病,2型糖尿病(diabetes mellitus typeⅡ,T2DM)占全部糖尿病的90%以上[1]。慢性牙周炎(chronic peridontitis,CP)是一種高發的發生于牙齒周圍支持組織的慢性感染性疾病。大量研究證實,牙周炎和糖尿病之間存在雙向關系,二者的免疫病理特征均是以慢性炎癥和免疫失衡為主[2]。T輔助細胞17(T helper cells 17,Th17)能夠特異性分泌IL-17,從而在促炎和介導自身免疫中發揮重要作用。本研究通過2×2析因設計檢測T2DM伴CP患者外周血中的Th17及IL-17水平,分析其與牙周狀態和血糖控制的關系,初步闡明Th17/IL-17在T2DM伴CP中的作用和意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 病例選擇及分組 選擇2018年7月至2019年7月就診于新疆維吾爾自治區人民醫院內分泌科的T2DM合并CP患者共60例,均符合1999年WHO關于T2DM的診斷標準及2012年美國牙周病協會制定的關于牙周炎分類標準[3-4]。所有受檢者均經新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會批準(倫理批件編號2016029),且患者知情同意。采用2×2析因設計,根據牙周狀態和血糖控制情況分為:HbA1c＜7%的T2DM伴輕度CP(Ⅰ組)15例；HbA1c≥7%的T2DM伴輕度CP(Ⅱ組)15例；HbA1c＜7%的T2DM伴中重度CP(Ⅲ組)15例；HbA1c≥7%的T2DM伴中重度CP(Ⅳ組)15例。

1.1.2 診斷標準 ①1999年WHO關于T2DM的診斷標準,即空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)兩小時血糖≥11.1 mmol/L[3]；②根據2012年美國牙周病協會關于CP的分類標準,即輕度牙周炎:≥2個鄰面位點CAL≥3 mm和≥2個鄰面位點PD≥4 mm(不在同一顆牙上)或1個鄰面位點(PD≥5 mm)；中度牙周炎:≥2個鄰面位點CAL≥4 mm(不在同顆牙上),或≥2個鄰面位點PD≥5 mm(不在同顆牙上)；重度牙周炎:≥2個鄰面位點CAL≥6 mm(不在同顆牙上)和≥1個鄰面位點PD≥5 mm。因重度牙周炎病例數較少,本研究將中度與重度牙周炎納入一組,合并為中重度CP組[4]。

1.1.3 納入標準 ①口內余留牙不少于20個；②近半年內未行牙周治療,3個月內未服用抗生素或非甾體類抗炎藥物；③接受正規治療,采用口服降糖藥物或注射胰島素治療,近期病情無變化。

1.1.4 排除標準 ①合并嚴重的肝腎功能不全者；②合并感染性疾病；③惡性腫瘤患者；④自身免疫性疾病患者；⑤合并糖尿病其余并發癥(腎病、視網膜病、神經病等)者。

1.1.5 主要試劑及儀器 抗人CD3、CD4、IL-17A單克隆抗體(美國Biolegend公司)；佛波酯(PMA)、離子霉素(IO)、蛋白轉運抑制劑(BFA)(美國Biogems公司)；淋巴細胞分離液(天津華科生物有限公司)；人IL-17 ELISA試劑盒(美國R&D公司)；FACS Canto TMⅡ流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 牙周指標檢查 對所有研究對象進行牙周檢查,每顆牙均做頰、舌側的遠中、正中和近中6個位點記錄,統一使用Williams牙周探針進行探診深度(probing depth,PD)、出血指數(bleeding index,BI)檢查。6個位點的PD和BI平均值即為每顆牙的結果,受檢牙的平均值即為患者的平均結果。同時拍攝曲面斷層片,輔助診斷。

1.2.2 外周血中Th17、Treg水平的檢測 分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC):清晨空腹采集受檢者外周靜脈血4 ml,肝素抗凝,離心取血漿,-80℃保存待測。經Ficoll密度梯度離心分離PBMC。Th17檢測:將PBMC轉移至24孔板,使用刺激物PMA和IO作用1 h后,加入BFA,置于37℃培養箱中培養4 h刺激細胞活化,并設置同型對照組,然后標記CD3、CD4抗體,破膜孵育后標記IL-17A抗體,測定Th17細胞百分比。

1.2.3 血清中IL-17檢測 將血清按ELISA說明書檢測IL-17,酶標儀測定450 nm處吸光度值,繪制標準曲線,計算細胞因子實際濃度。

1.3 統計學分析 使用SPSS24.0進行統計分析,正態資料以表示,方差齊時組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA),組內兩兩比較采用SNK檢驗。2×2析因分析牙周狀態與血糖控制對Th17和IL-17的交互作用,若差異有統計學意義,則隨后進行單獨效應分析。所有統計均采用雙側檢驗,檢驗水準α=0.05,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料及臨床參數 各組間年齡、性別、收縮壓、舒張壓差異均無統計學意義(P＞0.05),Ⅱ組和Ⅳ組的FPG、HbA1c較Ⅰ組和Ⅲ組明顯更高(P＜0.05),Ⅲ組和Ⅳ組的PD、BI較Ⅰ組和Ⅱ組更高(P＜0.05)。見表1。

2.2 外周血中Th17和IL-17的變化 圖1 A圈出部分表示淋巴細胞及CD3+CD4+T細胞亞群,圖1B為每組單個患者的典型Th17(CD3+CD4+IL-17A+)細胞流式圖。從圖1B和圖2A中可以看出Ⅳ組的Th17細胞比例明顯較其他3組更高[(1.36±0.36)% vs(0.86±0.31)%,(0.94±0.30)%,(0.92±0.33)%,P＜0.05]。由圖2B可見Ⅳ組的IL-17濃度較其他3組更高[(65.08±18.79)pg/ml vs(39.45±16.16)pg/ml,(44.14±18.34)pg/ml,(41.66±16.65)pg/ml,P＜0.05)]。

2.3 主效應分析 主效應分析發現牙周狀態和血糖控制對Th17(F=4.396,P=0.041)和IL-17(F=4.29,P=0.043)存在明顯交互作用(表2)。由圖3可知,牙周狀態和血糖控制對Th17和IL-17存在協同升高作用。

表1 研究人群的臨床和牙周參數(，n=15)Tab.1 Clinical and periodontal parameters of the study population(，n=15)

表1 研究人群的臨床和牙周參數(，n=15)Tab.1 Clinical and periodontal parameters of the study population(，n=15)

Note:1)P＜0.05 vs GroupⅠ；2)P＜0.05 vs GroupⅡ；3)P＜0.05 vs GroupⅢ.

Index GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣAge(year) 46.6±10.31 54.13±11.54 51.6±9.62 51.6±9.02 Male(%) 47 60 53 60 Systolic blood pressure(mmHg) 129.40±20.70 133.80±23.68 125.73±20.20 129.13±13.99 Diastolic blood pressure(mmHg) 77.60±11.75 79.87±10.20 80.00±13.20 78.47±9.22 FPG(mmol/L) 7.58±1.79 9.35±2.031)3) 7.62±1.73 9.58±2.081)3)HbA1c(%) 6.29±0.29 8.02±0.491)3) 6.47±0.34 8.03±0.461)3)PD(mm) 4.37±0.67 4.58±0.44 6.37±0.641)2) 6.42±0.521)2)BI 1.66±0.65 1.53±0.60 2.40±0.841)2) 2.22±0.621)2)

圖1 每組中單個患者的Th17(CD3+CD4+IL-17A+)細胞典型流式圖Fig.1 Representative flow cytometry results of Th17 cells(CD3+CD4+IL-17A+)from a single patient in each group

圖2 各組Th17及IL-17水平Fig.2 Levels of Th17 cells and IL-17 in each group

表2 PD和HbA1c對Th17/IL-17的主效應Tab.2 Main effect of PD and HbA1c on Th17/IL-17

圖3 牙周狀態與血糖控制對Th17和IL-17的交互圖Fig.3 Interactions between periodontal status and glycemic control as observed for Th17 cells and IL-17

表3 PD和HbA1c對Th17/IL-17的單獨效應Tab.3 Individual effects of PD and HbA1c on the Th17/IL-17

2.4 單獨效應分析 在牙周狀態較輕或血糖控制較好時,血糖控制或牙周狀態對Th17和IL-17的單獨效應均無統計學意義(P＞0.05)。在牙周狀態較差時,血糖控制對Th17和IL-17存在單獨效應(分別為F=13.572和13.405,P＜0.05)；在血糖控制較差時,牙周狀態對Th17和IL-17存在單獨效應(分別為F=12.478和10.716,P＜0.05)。見表3。

3 討論

大量研究證實,牙周炎和DM之間存在雙向關系,但其雙向關系的機制仍沒有得到充分闡述,越來越多的研究集中于探討牙周炎與DM的免疫炎癥反應機制。T2DM的發病基礎是胰島素抵抗(insulin resistance,IR),既往研究表明,IL-17的分泌失調會導致促炎細胞因子的過度表達和慢性炎癥,這種炎癥狀態可能在胰島素抵抗的進展中起重要作用[5-6]。牙菌斑作為牙周病的始動因子,除了菌斑生物膜的直接損害以外,微生物引起機體過度或失衡的免疫反應被認為是導致牙周組織廣泛破壞的重要因素[7]。Th17細胞通過分泌特異性細胞因子IL-17在牙周炎中發揮重要免疫調節作用,IL-17受體信號一方面通過刺激上皮細胞產生抗菌肽從而保護牙周組織,另一方面,過度的IL-17信號轉導可作用于成纖維細胞和成骨細胞,引起結締組織破壞和牙槽骨吸收[8]。Th17細胞及其細胞因子IL-17在T2DM和CP中均可發揮重要作用,但對于Th17細胞以及IL-17在T2DM合并CP患者的研究較少[9-10]。本實驗擬研究T2DM合并CP患者外周血Th17細胞比例及血清IL-17水平變化,及其與牙周狀態和血糖控制的關系,探討Th17/IL-17在T2DM與CP雙向關系中的作用和意義。

根據2×2析因設計,將HbA1c≥7%認為血糖控制較差,根據美國牙周病協會將CP分為輕度和中重度CP,將T2DM伴CP患者分為4組。單因素方差分析顯示血糖控制較差并伴中重度CP組的Th17和IL-17水平明顯較其他3組更高(P＜0.05),表明血糖控制較差的T2DM伴中重度CP患者體內存在更重的免疫炎癥反應。較差的血糖控制情況及較重的牙周炎癥狀態可能會過度刺激Th17細胞,從而引起IL-17等炎癥因子的激活和釋放。IL-17與受體結合,可激活上游NF-K B、AP1、C/EBP信號傳導通路,誘導產生多種炎癥介質,引起炎癥細胞浸潤和組織損傷[11]。SANTOS等[12]發現與血糖控制良好的糖尿病患者相比,血糖控制不佳患者的齦溝液中IL-17濃度更高,說明血糖控制不良時,更易促進局部促炎細胞因子聚集,引起牙周組織免疫失調,增加DM患者牙周炎的患病可能性。與本研究結果類似,鄧秋艷等[13]的研究表明IL-17可能是牙周炎發生重要促炎細胞因子,DM可能通過Th17細胞亞群共同發揮致病作用。

析因分析結果顯示,牙周狀態和血糖控制對Th17和IL-17水平存在交互作用。進一步分析單獨效應顯示,牙周狀態對Th17和IL-17的單獨效應隨著血糖控制水平的不同而不同,結合交互圖可以看出,牙周狀態和血糖控制對Th17和IL-17存在協同升高作用,提示在T2DM伴CP患者中,血糖控制越差、牙周炎的程度越重,Th17細胞比例和IL-17濃度越高,炎癥反應越重。與BELKINA等[14]的研究一致,其研究發現T2DM患者的免疫反應增強與牙周病的嚴重程度有關。中重度CP患者牙周袋內過量的IL-17可能通過牙周袋潰瘍面進入血液循環,IL-17參與中性粒細胞的活化、成熟,高度活化的中性粒細胞可能是重要的活性氧來源,引起氧化應激,使NF-κB的抑制物激酶(inhibitory kinase,IKK)激活,干擾正常的胰島素傳導通路,導致胰島素抵抗；同時,IKK可激活NF-κB炎癥信號通路,產生TNF-α、IL-17等炎癥細胞因子,導致炎癥反應出現形成一個反饋通路,導致T2DM的慢性炎癥狀態[15]。氧化應激是導致DM并發癥的主要因素之一,也是影響中性粒細胞增加的另一個因素[16]。高血糖條件下晚期糖基化終產物的積累可刺激循環中的中性粒細胞。因此,Th17細胞比例和血清IL-17濃度在血糖控制較差的T2DM合并中重度CP中明顯升高,可能與氧化應激的增加和晚期糖基化終產物的產生有關,而較重牙周炎癥狀態和較差血糖控制對Th17和IL-17存在協同升高作用,這些因素能夠促進T2DM患者炎癥的惡化。

綜上所述,血糖控制較差的T2DM伴中重度CP患者的外周血Th17細胞比例和血清IL-17濃度明顯升高,且牙周狀態和血糖控制可能對Th17和IL-17存在協同升高的作用,由此推測Th17/IL-17可能在T2DM和CP的雙向關系中具有重要作用,但其確切的致病機制仍需進一步深入探討。