鼠傷寒沙門菌SseK1蛋白的表達及其免疫生物學特性研究①

路 霞 楊亞東 郁 川 杜付玉 張春杰

（河南科技大學動物科技學院/洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，洛陽 471023）

新發傳染病是威脅人類健康和生命安全的重大醫學問題，鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）是一種對人類健康和養殖業構成嚴重威脅的重要病原菌，目前該菌在我國的感染發病率居沙門菌感染的首位［1-2］。沙門菌感染常用抗生素進行治療，而抗生素的使用導致臨床沙門菌耐藥菌株不斷產生，使藥物難以治療鼠傷寒沙門菌引起的各種疾病［3］。近幾年來，亞單位疫苗備受研究者的青睞，亞單位疫苗不僅組分明確、安全性良好，且生產便利［4］。因此，對鼠傷寒沙門菌潛在的毒力因子或保護性抗原的研究尤為重要。研究發現SseK1（Salmonella secreted effector K1）是一種由鼠傷寒沙門菌致病島SPI-2上的毒力基因所編碼并由Ⅲ型分泌系統（typeⅢsecretion system，T3SS）分泌的效應蛋白。其通過T3SS分泌系統被遞送到宿主細胞中，使細菌能夠侵入并持續存在于宿主體內［5-7］，而國內有關效應蛋白SseK1引起的炎癥反應及該蛋白的抗原性研究尚未見報道，因此，本研究對鼠傷寒沙門菌SL1344的sseK1基因進行了克隆表達和純化，并對其免疫生物學特性作了初步分析，為進一步研究鼠傷寒沙門菌與機體在感染和免疫方面的相互作用以及新型重組亞單位疫苗的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及表達載體 鼠傷寒沙門菌SL1344、表達載體pET-32a、DH5α感受態細胞和大腸桿菌BL21都由本實驗室保存；克隆載體pMD-18-T購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 主要試劑及試劑盒 鎳柱親和層析蛋白純化試劑盒、Taq PCR Master Mix（2×，blue dye）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ，T4 DNA連接酶，DNA marker購自碧云天生物有限公司；質粒小量提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自康寧生命科學（吳江）有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自Sigma公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG均購自寶生物工程（大連）有限公司；6～8周齡BALB/c雌性小鼠購自鄭州大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 根據GenBank已公布的鼠傷寒沙門菌SL1344株sseK1基因序列（登錄號No.FQ321003.1）設計sseK1基因的PCR引物。F：5′-GGATCCATGATCCCACCATTAAATAG-3′（下 劃線處為BamⅠ酶切位點）；R：5′-AAGCTTCTACTG?CACATGCCTCGC-3′（下劃線處為HindⅢ酶切位點）。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.2.2 pMD-18-T-sseK1的構建與鑒定 為獲得sseK1基因片段，本研究以鼠傷寒沙門菌SL1344作為模板，通過PCR方法進行擴增。PCR反應程序為：95℃5 min初始變性；95℃30 s，56℃30 s，72℃80 s，30個循環；72℃延伸10 min，瓊脂糖凝膠回收PCR擴增出的sseK1片段，并連接至pMD18-T克隆載體，將攜帶有sseK1基因的克隆載體pMD18-TsseK1轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α中進行擴增，對構建的pMD18-T-sseK1重組質粒進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，鑒定正確后送至生工生物工程（上海）股份有限公司對其序列進一步測序。

1.2.3 pET-32a-sseK1重組表達載體的構建與鑒定 利用限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ對構建重組質粒pMD-18T-sseK1進行雙酶切鑒定正確后連接至質粒pET-32a，然后將攜帶有sseK1基因的原核表達載體pET-32a-sseK1轉化至感受態細菌BL21中，經PCR和雙酶切進行鑒定，構建sseK1基因原核表達菌（pET-32a-SseK1-BL21）。

1.2.4 重組菌的蛋白表達純化及Western blot鑒定 用終濃度為1 mmol/L的IPTG對重組菌BL21（pET-32a-SseK1）進行誘導表達。用PBS重懸收集的菌體并冰浴超聲，超聲后分離上清和沉淀，按一定比例加入含β-巰基乙醇的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸處理后SDS-PAGE檢測重組菌的蛋白表達情況。用鎳離子親和層析法純化重組蛋白，然后將純化的SseK1蛋白與兔抗鼠傷寒沙門菌陽性血清反應，進行Western blot鑒定。

1.2.5 鼠傷寒沙門菌標準強毒株LD50的測定 正式實驗的最高與最低劑量分別是在預實驗中求得BALB/c小鼠全死亡或90%以上死亡的劑量和動物不死亡或10%以下死亡的劑量。根據預實驗結果，隨機將小鼠分為5組，每組6只，選取合適的菌落稀釋度，實驗組小鼠每個稀釋度灌胃感染劑量為200μl/只，對照組小鼠灌胃等量的無菌生理鹽水。灌胃感染后，準確記錄小鼠死亡情況。同時，從死亡小鼠分離細菌并用沙門菌特異性引物進行鑒定，Bliss法計算鼠傷寒沙門菌標準強毒株SL1344對小鼠的LD50。

1.2.6 小鼠免疫試驗 實驗分為實驗1組和實驗2組，對照1組和對照2組。每組8只6周齡BALB/c小鼠，免疫劑量為實驗組小鼠每只100μg重組蛋白，SseK1蛋白與Montanide ISA 201 VG佐劑按體積比4.6∶5.4充分混合乳化，小鼠免疫方式采用背部皮下多點注射，背部皮下注射5個注射點，總計1 ml。免疫對照組小鼠以等量的佐劑與PBS混合后免疫。在小鼠一免14 d后加強一次免疫，免疫劑量和途徑與一免相同。二免后第7天、第14天、第21天和第28天進行眼底采血，ELISA方法檢測抗體效價。

1.2.7 抗體效價檢測 上述免疫小鼠眼底采血后進行血清分離，用純化的SseK1蛋白（濃度為5μg/ml）作為抗原進行包被，采用間接ELISA方法檢測抗體效價。效價定義為：P為陽性450 nm處的吸光度值，N為陰性對照450 nm處的吸光度值，當P/N≥2.1判為陽性，P/N＜1.5判為陰性。抗血清的效價為陽性血清的最大稀釋比例。

1.2.8 小鼠淋巴細胞增殖轉化試驗 參考文獻［8］方法，在小鼠二免14 d后，從每組中隨機取3只小鼠無菌摘取脾臟，分離脾臟淋巴細胞，用RP?MI1640培養液懸浮細胞，調整細胞濃度為1×106個/ml，每孔100μl接種于96孔細胞培養板，37℃，5% CO2條件下培養。以SseK1或ConA刺激細胞（5μg/孔），每孔設3個重復，培養72 h后加入MTT溶液（5 mg/ml）20μl/孔，繼續孵育4 h后終止培養，棄去培養上清液，按150μl/孔加入DMSO，振蕩10 min使結晶物充分溶解。酶標儀檢測OD490nm。

1.2.9 小鼠攻毒試驗 按照上述1.2.6方法免疫小鼠，在小鼠二免14 d后，分別對實驗1組和對照1組小鼠進行灌胃攻毒SL1344強毒株100μl（3.16×105CFU），實驗2組和對照2組小鼠則正常飼喂。攻毒后記錄免疫小鼠死亡情況，從而對SseK1蛋白的免疫保護作用進行評價。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0對實驗數據進行統計學分析，計量資料用±s表示，兩組間差異比較采用Students't檢驗，多重比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pMD-18-T-sseK1的構建和鑒定 以鼠傷寒沙門菌SL1344為模板，用所設計的sseK1引物PCR擴增出目的片段sseK1，經1.0%瓊脂凝膠電泳顯示：成功擴增出約1 000 bp大小的目的條帶（圖1A），與預期1 011 bp相符。用限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ對構建的pMD-18T-sseK1重組質粒進行雙酶切鑒定，結果出現約為2 600 bp的載體條帶和約1 000 bp的目的條帶（圖1B），表明重組質粒pMD-18-T-sseK1構建正確。隨后將構建正確的重組質粒pMD-18-TsseK1送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，結果與GenBank中的鼠傷寒沙門菌SL1344株sseK1基因的同源性為100%，無差異，說明PCR擴增出的sseK1基因片段正確。

圖1 sseK1基因的PCR擴增（A）和pMD18-T-sseK1（B）的酶切鑒定Fig.1 PCR amplification of sseK1 gene（A）and identifica-tion of double enzyme for pMD18-T-sseK1（B）

2.2 pET-32a-sseK1重組質粒的構建與鑒定 挑取含有pET-32a-sseK1重組質粒的菌落，提取PCR鑒定的陽性菌落的重組質粒，用限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切鑒定，電泳可見約6 000 bp載體條帶和1 000 bp的目的條帶（圖2），與預期結果相符，說明原核表達載體構建成功。

圖2 pET-32a-sseK1的酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion identification of pET-32asseK1

2.3 pET-32a-sseK1的誘導表達純化及Western blot分析結果 在適宜條件下，對pET-32a-SseK1重組菌進行誘導表達和純化。SDS-PAGE分析顯示，表達的融合蛋白在約43 kD處有表達帶（圖3），說明該蛋白主要以可溶性蛋白形式存在于菌體超聲破碎后的上清中。經鎳柱親和層析純化后可見較純的融合蛋白條帶，經Western blot鑒定，該重組表達蛋白大小正確，為SseK1蛋白（圖4）。

圖3 重組蛋白SseK1的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein SseK1

圖4 重組蛋白的Western blot鑒定Fig.4 Western blot identification of recombinant protein

2.4 LD50的測定 用標準強毒株對小鼠口服感染，實驗組小鼠均出現不同程度的死亡。從死亡小鼠中分離的細菌均能用pi1/pi2引物擴增出約580 bp的特異性條帶；對照組小鼠存活正常。Bliss法計算鼠傷寒沙門菌標準強毒株SL1344灌胃感染小鼠的LD50為3.16×105CFU（表1）。

表1 鼠傷寒沙門菌標準強毒株SL1344的毒力測定Tab.1 Mortality of mice after infection with Salmonella typhimurium SL1344

2.5 重組蛋白誘導的抗體反應 用重組蛋白對小鼠進行二免后第7天即可誘導產生一定水平的特異性抗體，小鼠血清抗體效價達到1∶14 000，而佐劑與PBS組則未產生特異性抗體；第14天血清抗體效價均為1∶38 000；第21天抗體效價達到最大，為1∶124 000；第28天效價與第21天相比較抗體效價有所降低，為1∶46 000；且實驗組IgG水平均顯著高于佐劑與PBS混合組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.6 細胞免疫反應 以SseK1（5μg/孔）對小鼠脾臟淋巴細胞進行刺激，陽性對照組以相同劑量的ConA刺激，對于陰性對照組則不作處理。結果表明，只有以SseK1刺激的實驗組和以ConA刺激的陽性對照組產生了顯著的T淋巴細胞增殖反應，差異具有統計學意義（P＜0.01，圖5）。

圖5 小鼠T淋巴細胞增殖轉化試驗結果Fig.5 T lymphocyte proliferation in immunized mice

2.7 重組蛋白對小鼠免疫保護效果檢測 小鼠死亡情況為：7 d內，對照1組小鼠全部死亡；實驗1組死亡1只；8～15 d內，實驗1組小鼠死亡2只，其余5只一直存活至觀察期結束，觀察期為14 d；對照2組和實驗2組小鼠均正常存活。鼠傷寒沙門菌強毒株對重組蛋白SseK1二免14 d后的小鼠攻毒產生60%以上的免疫保護率。

3 討論

鼠傷寒沙門菌是一種導致人和多種動物食源性感染和胃腸道感染的重要病原菌，嚴重時能夠引起哺乳動物和人死亡，對公共衛生構成了重大的負擔［9-10］。近年來，沙門菌病主要靠藥物預防和治療，但是由此引發了沙門菌耐藥株的產生和動物食品藥物殘留等嚴重問題。目前，亞單位疫苗及重組疫苗已逐漸成為人們研究的熱點，其中亞單位疫苗因為組成成分明確，結構簡單，安全和特異性好而備受研究者的關注［11］。而篩選有效的免疫抗原蛋白是制備新型高效沙門菌亞單位疫苗的基礎和關鍵，這些保護性抗原的鑒定為新一代的亞單位疫苗的研制提供了方向。

在感染宿主過程中許多細菌通過表達毒力基因做出響應，在宿主致病的發生發展中發揮作用，而那些在宿主體內表達的毒力基因，如果其編碼的蛋白質具有抗原性，那么這些基因對研究病原菌致病機理及研制安全有效的疫苗則具有重要的研究意義［12-13］。沙門菌毒力的一個重要組成部分是沙門菌毒力島SPI-2編碼的T3SS分泌系統。通過這種蛋白分泌系統，沙門菌能將囊泡中的效應蛋白轉運到宿主細胞中，干擾先天免疫應答所需要的關鍵信號傳 導 途 徑［14］。SseK1（Salmonella secreted effector K1）作為鼠傷寒沙門菌致病島SPI-2編碼的一個重要的效應分子，已被鑒定為鼠傷寒沙門菌感染宿主細胞過程中必不可少的毒力蛋白［15］。另外有研究表明SseK1可通過調控宿主細胞上的NF-κB信號通路來調控沙門菌對于細胞的侵染，在沙門菌的致病中發揮著重要作用，且SseK1基因在沙門菌染色體基因組上高度保守，具有良好的研究價值［16］。而關于鼠傷寒沙門菌SseK1蛋白結構功能及免疫原性的研究在國內尚未見報道。因此，本實驗克隆了鼠傷寒沙門菌SseK1基因，在大腸桿菌BL21中進行了誘導表達，并對其免疫生物學特性做了初步研究。

研究表明，重組蛋白SseK1經SDS-PAGE分析，在約43 kD處有比較明顯的特異蛋白表達帶，與預期大小一致。Western blot分析顯示，純化后的SseK1重組蛋白可與兔抗鼠傷寒沙門菌陽性血清反應，在約43 kD處有SseK1重組蛋白單一條帶，表明SseK1蛋白具有良好的反應原性。在重組蛋白SseK1誘導抗體反應中，二免后第21天抗體效價達到最大，為1∶124 000，并于第4周起降低，且實驗組IgG水平均顯著高于佐劑與PBS混合組，差異具有統計學意義（P＜0.05），該結果與LIAUDET等［17］將純化后沙門菌重組鞭毛蛋白腹腔注射小鼠后而引起的血清中相關炎癥因子分泌量增加的研究結果相似；在細胞免疫反應中，小鼠脾臟淋巴細胞以SseK1蛋白刺激的實驗組和以相同劑量ConA刺激的陽性對照組均產生了顯著的T淋巴細胞增殖反應，差異具有統計學意義（P＜0.01），陰性對照組并未引起，說明SseK1能夠有效地刺激機體的免疫功能。在重組蛋白對小鼠的免疫保護效力檢測中，重組蛋白Ssek1二免14 d后的小鼠對鼠傷寒沙門菌強毒株攻毒產生60%以上的免疫保護率，充分表明重組sseK1蛋白具有良好的免疫原性和保護效力。

綜上所述，鼠傷寒沙門菌SseK1重組蛋白可被兔抗鼠傷寒沙門菌陽性血清識別，具有較高的抗體效價，能夠顯著刺激小鼠T淋巴細胞增殖，并能提供較好的免疫保護效力，表明SseK1蛋白具有生物學活性和良好的抗原性，能激發機體產生強烈的細胞免疫應答和較好的體液免疫應答，可以作為重組亞單位疫苗的候選抗原蛋白，為深入研究鼠傷寒沙門菌與機體在感染和免疫方面的相互作用奠定了一定的理論基礎。