白及多糖通過調節免疫作用抑制結腸癌CT26荷瘤小鼠腫瘤生長

劉文立 莫海云（南華大學附屬南華醫院腫瘤科，衡陽 421002）

結腸癌作為胃腸道常見的惡性腫瘤，其發病率和致死率呈逐年上升趨，目前臨床上治療人結腸癌的首選方法為手術切除并輔以化療，但化療會對正常細胞造成一定的損傷且易于復發，部分患者因不能忍受其痛苦過程而放棄治療，且抗腫瘤化療藥物毒副作用大，長期使用易產生耐藥［1-2］。中藥因其療效好、毒副作用少而在腫瘤的治療中體現了獨特優勢。近年來，免疫類中藥多糖因具有調節機體免疫功能、抗腫瘤活性顯著和毒副作用小等特點被廣泛應用于臨床輔助治療［3-4］。白及多糖（bletilla striata polysaccharide，BSP）是中藥白及中分離制備得到的一種具有確定組成和結構的新型葡萄甘露聚糖，有關其止血、抗胃潰瘍、免疫調節、損傷修復等藥效已多有報道［5-6］。本研究通過觀察白及多糖對結腸癌CT26荷瘤小鼠的抗腫瘤活性和免疫調節作用，探討其可能調節機制，以期為白及多糖的臨床應用提供思路和依據。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠結腸癌CT26細胞株購自美國ATCC細胞庫。30只SPF級健康BALB/c裸鼠，鼠齡6～7周，體重（20±2）g，由湖北省動物實驗中心提供，動物合格證編號：SCXK（鄂）2018-0020。白及多糖購于陜西慈緣生物科技有限公司，批號：20180913；香菇多糖購于陜西方晟生物科技有限公司，批號：BZ-201；MTT檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；IL-2、IFN-γELISA試劑盒購于美國R&D公司；APC-CD3e抗體、PE-CD4抗體、PE-CD8a抗體均購自美國BD公司；TLR4、My D88、NF-κB p65抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。酶標儀購于美國Thermo Fisher Science公司；全自動生化分析儀購于Beckman Coulter公司；全自動數碼凝膠圖像分析系統購于上海天能科技有限公司；流式細胞儀購于美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 右前肢皮下接種CT26細胞（0.2 ml，1×107個/ml），接種1周左右時，接種處可見平均直徑約5 mm的腫瘤視為造模成功［7］。

1.2.2 動物分組與給藥 將模型裸鼠分為荷瘤模型組（Model）、白及多糖低劑量組［BSP-L，100 mg/(kg·d）］、白及多糖高劑量組［BSP-H，400 mg/（kg·d）］和陽性藥物香菇多糖組［LNT，150 mg/（kg·d）］，每組6只；另取6只健康裸鼠作為對照組（Control）。皮下接種1周后開始灌胃給藥，連續給藥3周，其中對照組和模型組每天給予與藥物組等量生理鹽水灌胃［8］。

1.2.3 腫瘤生長曲線繪制及抑瘤率計算［9］從接種腫瘤細胞第1天起，每3 d用游標卡尺測量1次腫瘤的長徑（a）和短徑（b），計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，取瘤稱重計算抑瘤率。其中，腫瘤體積：V=ab2/2；抑瘤率=（1-實驗組瘤質量/模型組瘤質量）×100%。

1.2.4 免疫器官指數計算［10］摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，取各組小鼠脾臟和胸腺，稱量質量，計算脾臟指數和胸腺指數。臟器指數=臟器質量（mg）/鼠體質量（g）。

1.2.5 MTT法測小鼠脾臟淋巴細胞增殖活性［11］收集各組小鼠脾臟組織制成單細胞懸液，PBS調整細胞濃度至2×103個/孔接種于96孔板，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，分組處理后每孔加20μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續培養4 h；吸去上清，每孔加入150μl DMSO溶解液，置于搖床低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值（OD490），以OD490值表示細胞活力。

1.2.6 ELISA法檢測血清免疫因子水平［12］摘眼球取血，3 000 r/min離心5 min分離血清，按照試劑盒說明書進行操作，酶標儀于450 nm波長處測定各孔OD值，根據標準曲線計算血清中IL-2和IFN-γ含量。

1.2.7 流式細胞術檢測外周血T淋巴細胞亞群［11］另取肝素抗凝血20μl，加入180μl紅細胞裂解液，混勻后，靜置10 min棄去上清液，PBS沖洗2次后重懸白細胞，加入APC-CD3e、PE-CD4和PE-CD8a抗體混合抗體，避光孵育15 min后上機檢測，收集數據，Cellqeust軟件分析CD4+T細胞（CD3e+CD4+）、CD8+T細胞（CD3e+CD8+）百分比，并計算CD4+/CD8+。

1.2.8 Western blot法檢測脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平［12］取各組小鼠脾臟組織稱質量后加入預冷的組織蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑勻漿，冰上碾磨組織，4℃條件下12 000 g離心20 min，收集上清，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取20μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，并將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入TLR4、MyD88、NF-κB p65抗體和β-actin抗體，4℃孵育過夜。次日，加入相應二抗室溫孵育1 h，ECL試劑曝光顯影，在全自動凝膠成像系統中曝光顯影。目的蛋白的相對表達量用目的蛋白與β-actin灰度值比表示。

1.3 統計學分析 所有數據均采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白及多糖對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響 如圖1所示，BSP-H組和LNT組移植瘤生長較Model組緩慢，且接種第22天時BSP-H組和LNT組移植瘤體積顯著小于Model組（P＜0.01），而BSP-L組與Model組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。如表1所示，與Model組相比，BSP-H組和LNT組移植瘤重量顯著降低（P＜0.01），抑瘤率顯著增加（P＜0.01），而BSP-L組差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 白及多糖對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響Fig.1 Effects of BSP on tumor growth in tumor-bearing mice

表1 白及多糖對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用（±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effect of BSP on tumor of tumor-bear-ing mice（±s，n=6）

表1 白及多糖對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用（±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effect of BSP on tumor of tumor-bear-ing mice（±s，n=6）

Note：1）P＜0.01，compared with Model group.

Inhibition rate（%）0 4.10 62.801）78.161）Groups Model BSP-L BSP-H LNT Tumor weight（g）2.93±1.10 2.81±0.62 1.09±0.711）0.64±0.871）

2.2 白及多糖對荷瘤小鼠免疫器官的影響 如表2所示，與Control組相比，Model組小鼠脾臟指數和胸腺指數均顯著下降（P＜0.01）；與Model組相比，BSPH組和LNT組小鼠脾臟指數和胸腺指數均顯著上升（P＜0.01），而BSP-L組差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟和胸腺指數的影響（±s，n=6，mg/g）Tab.2 Effect of BSP on Spleen and thymus index in tu-mor-bearing mice（±s，n=6，mg/g）

表2 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟和胸腺指數的影響（±s，n=6，mg/g）Tab.2 Effect of BSP on Spleen and thymus index in tu-mor-bearing mice（±s，n=6，mg/g）

Note：1）P＜0.01，compared with Control group；2）P＜0.01，compared with Model group.

Thymus index 5.73±0.45 4.01±0.361）4.75±0.17 5.22±0.502）5.27±0.282）Groups Control Model BSP-L BSP-H LNT Spleen index 8.61±0.60 6.53±0.331）7.23±0.37 7.90±0.182）8.12±0.192）

2.3 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟淋巴細胞活性的影響 如圖2所示，與Control組相比，Model組小鼠脾臟淋巴細胞活性顯著下降（P＜0.05）；與Model組相比，BSP-H組和LNT組小鼠脾臟淋巴細胞活性顯著上升（P＜0.05），而BSP-L組差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟淋巴細胞活性的影響Fig.2 Effects of BSP on lymphocyte activity in spleen of tumor-bearing mice

2.4 白及多糖對荷瘤小鼠血清免疫因子水平的影響 如圖3所示，與Control組相比，Model組小鼠血清中免疫因子IL-2、IFN-γ水平顯著下調（P＜0.05或P＜0.01）；與Model組相比，BSP-H組和LNT組小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平顯著上調（P＜0.05），而BSPL組差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 白及多糖對荷瘤小鼠血清中IL-2和IFN-γ含量的影響Fig.3 Effects of BSP on IL-2 and IFN-γlevels in serum of tumor-bearing mice

2.5 白及多糖對荷瘤小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響 如表3所示，與Control組相比，Model組小鼠外周血CD4+/CD8+顯著降低（P＜0.05）；與Model組相比，BSP-H組和LNT組小鼠外周血CD4+/CD8+顯著上升（P＜0.05），而BSP-L組差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 白及多糖對荷瘤小鼠外周血CD4+和CD8+比例的影響（±s，n=6）Tab.3 Effect of BSP on levels of CD4+and CD8+in serum of tumor-bearing mice（±s，n=6）

表3 白及多糖對荷瘤小鼠外周血CD4+和CD8+比例的影響（±s，n=6）Tab.3 Effect of BSP on levels of CD4+and CD8+in serum of tumor-bearing mice（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05，compared with control group；2）P＜0.05，compared with model group.

CD4+/CD8+1.77±0.27 0.80±0.211）1.00±0.26 1.46±0.192）1.63±0.262）Groups Control Model BSP-L BSP-H LNT CD4+（%）43.43±4.08 25.73±4.821）29.38±2.55 38.73±3.222）40.97±5.272）CD8+（%）24.50±2.91 32.17±3.351）29.33±3.07 26.60±2.872）25.02±2.492）

2.6 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟組織TLR4/NF-κB通路蛋白表達的影響 如圖4所示，與Control組相比，Model組小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與Model組相比，BSP-H組小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88和NFκB p65蛋白表達水平顯著上升（P＜0.01），而BSP-L組和LNT組差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NFκB p65蛋白表達的影響Fig.4 Effects of BSP on protein expressions of TLR-4，MyD88，NF-κB p65 in spleen tissue of tumor-bear-ing mice

3 討論

由于結構上的多樣性和復雜性，多糖已成為當今最有魅力的信息載體之一。自上世紀80年代至今，已相繼報道了至少多種具有免疫調節、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗輻射、抗凝血、抗腫瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系統保護作用等多種生理活性的多糖，其中最重要的活性當推免疫調節作用。多糖因其增強機體免疫、輔助抗腫瘤及幾乎沒有毒性等優點成為當前的研究熱點［13］。本研究結果顯示，白及多糖可通過激活TLR4/NF-κB信號通路，增強結腸癌CT26荷瘤小鼠的免疫功能，從而起到抑制腫瘤生長的作用。

腫瘤的發生和發展與機體免疫功能的下降密切相關，脾臟和胸腺為重要的免疫器官，是發生免疫應答及合成免疫活性物質的重要場所，脾臟和胸腺指數在一定程度上反映了機體免疫功能的強弱。本研究結果顯示，與正常組相比，模型組荷瘤小鼠的脾臟指數和胸腺指數顯著降低，與模型組相比，白及多糖高劑量組的小鼠脾臟指數和胸腺指數顯著上升。說明腫瘤的出現引起了機體免疫器官的萎縮，而白及多糖具有降低模型小鼠脾臟和胸腺損傷的作用，能通過增強機體免疫功能發揮抗腫瘤作用。

腫瘤免疫分為免疫清除、免疫平衡和免疫逃逸3個階段，在免疫清除期，免疫系統可抑制腫瘤生長，起到免疫清除作用，其中IFN-γ、IL-2發揮重要作用［14］。本研究結果顯示，與正常組相比，模型組荷瘤小鼠血清中免疫因子IL-2、IFN-γ水平顯著下調，與模型組相比，白及多糖高劑量組的小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平顯著上升。說明白及多糖可通過調節血清免疫因子水平，增強機體免疫力，從而發揮抗腫瘤作用。

腫瘤可使機體細胞免疫和體液免疫發生異常改變。細胞免疫主要表現為T淋巴細胞亞群的改變，CD4+輔助性T細胞主要分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子，可誘導和增強細胞、體液免疫應答；CD8+T細胞可通過分泌抑制因子抑制CTL細胞和B淋巴細胞，起到負調節作用。兩種作用迥異的T淋巴細胞借其相互拮抗作用以保持免疫功能的平衡［15］。本研究結果顯示，與正常組相比，模型組荷瘤小鼠脾臟淋巴細胞活性顯著下降，外周血CD4+T淋巴細胞比例降低，CD8+T淋巴細胞比例升高，CD4+/CD8+比值降低。與模型組相比，白及多糖高劑量組小鼠脾臟淋巴細胞活性顯著上升，外周血CD4+T淋巴細胞比例上調，CD8+T淋巴細胞比例下調，CD4+/CD8+比值上升。提示白及多糖可增加小鼠體內T細胞數量，并通過上調CD4+T細胞，提高機體抗腫瘤能力。

TLR4/NF-κB通路是近些年來發現與抗炎免疫機制密切相關的信號通路，NF-κB信號通路受多種上游信號分子刺激而激活，TLR4是其中之一，其主要表達在免疫細胞表面，在介導固有免疫系統及中藥多糖主導的免疫力提升和細胞因子釋放中發揮重要作用［16］。本研究結果顯示，與正常組相比，模型組荷瘤小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低，與模型組相比，陽性藥物香菇多糖脾臟組織中相關蛋白無明顯變化，這主要與香菇多糖的作用機制有關，其主要是通過增強機體免疫力間接發揮抗腫瘤作用，而白及多糖高劑量組小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平顯著上升，提示白及多糖對腫瘤的抑制作用與TLR4/NF-κB信號通路的激活有關。

綜上所述，白及多糖可通過激活TLR4/NF-κB信號通路，增強結腸癌CT26荷瘤小鼠的免疫功能，從而起到抑制腫瘤生長的作用。且其在調節免疫功能方面的療效與目前廣泛應用于臨床的香菇多糖無明顯差異，說明白及多糖具有很大的開發利用價值。