TLR2、IL-10 mRNA的表達(dá)及樹突狀細(xì)胞分布在外陰硬化性苔蘚中的臨床意義①

王楠楠 王 婧 劉嗣同 武 昕（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽 110000）

外陰硬化性苔蘚（vulvar sclerosing lichen，VLS）是婦科常見的一種慢性難治性疾病，表現(xiàn)為女性外陰瘙癢、皮膚色素脫失、萎縮，嚴(yán)重者出現(xiàn)尿道口和陰道口狹窄，惡變率為2%～4%［1］。目前病因和發(fā)病機制尚不清楚，可能與自身免疫、感染、性激素和遺傳有關(guān)，也沒有較好的治療方法。因此，探討VLS發(fā)病機制是臨床上亟待解決的問題。因其真皮內(nèi)可見大量的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤，故多數(shù)學(xué)者認(rèn)為它是一種與自身免疫有關(guān)的疾病［1］。前期研究發(fā)現(xiàn)VLS中促炎因子干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α和白介素-1，2等明顯增多，而抗炎因子研究較少（IL-10）在VLS中表達(dá)情況尚未見報道［2-3］。Toll樣受體（TLR）是連接固有免疫與適應(yīng)性免疫的橋梁，TLR廣泛分布于多種細(xì)胞表面，其中TLR-2表達(dá)范圍最廣，TLR-2主要存在淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面，TLR-2通過影響T輔助細(xì)胞1（T helper cell1，Th1）和T輔助細(xì)胞2（T helper cell 2，Th2）的平衡，引起IFN-γ分泌降低，IL-10分泌相對升高，來抑制免疫反應(yīng)［4-5］。前期本課題組檢測到淋巴細(xì)胞CD4、CD8在VLS中真皮層明顯增多，而樹突狀細(xì)胞在VLS形成和發(fā)展作用如何？TLR2和IL-10是否表達(dá)異常，與病變關(guān)系如何？目前尚不清楚，因此，本研究探討TLR2、IL-10 mRNA和樹突狀細(xì)胞在VLS病變形成中作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2016至2018年在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科手術(shù)或活檢的VLS標(biāo)本50例（早期和進(jìn)展期各25例），外陰正常皮膚（源于外陰整形手術(shù)切除的正常組織）15例。部分福爾馬林溶液固定用于免疫組化實驗；部分新鮮標(biāo)本-80℃保存，用于PCR實驗。所有標(biāo)本診斷均經(jīng)2位病理醫(yī)生證實。本研究已通過中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審查。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人CD1α單克隆抗體、通用S-P超敏試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）；miRNeasy Mini Kit試劑盒（德國Qiagen公司）；β-actin、IL-10、TLR2引物（美國Invitrogen公司）；A5001反轉(zhuǎn)錄試劑盒及A6001 Real Time PCR試劑盒（美國Pro?mega公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測4μm石蠟切片，脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液熱抗原修復(fù)，采用免疫組織化學(xué)S-P法對CD1α細(xì)胞進(jìn)行染色。滴加過氧化物酶阻斷溶液（試劑A）室溫下孵育10 min，正常非免疫動物血清（試劑B）室溫下孵育20 min，再加一抗（CD1α單抗1∶100），37℃孵育1 h，生物素標(biāo)記的二抗（試劑C）室溫下孵育30 min，鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液（試劑D）室溫下孵育30 min，DAB呈色后蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作陰性對照。切片脫水后封片保存。

1.2.2 PCR檢測

1.2.2.1 總RNA的提取 使用miRneasy Mini Kit試劑盒抽提全部30例標(biāo)本組織RNA，操作按說明書進(jìn)行，RNA樣品保存于-80℃冰箱。

1.2.2.2 RNA的逆轉(zhuǎn)錄 ①取一定量模板RNA加入引物。②模板RNA與引物的混合物，70℃、5 min預(yù)變性，完成后取出置于冰上。③配置RT-Mix，向每個樣品管加入10μl RT-Mix，見表1。④設(shè)置反轉(zhuǎn)錄程序，包括退火（25℃，5 min）、延伸（42℃，60 min）、逆轉(zhuǎn)錄酶失活（70℃，15 min）三步。程序完成后得到cDNA，并存于-20℃冰箱，（按照promega A5001試劑說明書操作）。

表1 RT-Mix具體配置方法Tab.1 Specific configuration method of RT-Mix

1.2.2.3 RT-PCR（按照promega A6001試劑說明書操作）①按表2配置PCR反應(yīng)混合液，并分至各反應(yīng)管，然后加入2μl模板。②反應(yīng)體系加入96孔板，加蓋光學(xué)封口膜，離心后放入ABI 7900HT熒光定量PCR儀，PCR反應(yīng)條件為：95℃2 min，95℃15 s，60℃60 s，40個循環(huán)，實驗重復(fù)3次。③完成RTPCR后對其溶解曲線進(jìn)行分析，并結(jié)合瓊脂糖分析PCR產(chǎn)物是否特異。分析PCR反應(yīng)曲線，所得出的數(shù)據(jù)按2-ΔΔCT法計算出基因表達(dá)的相對量。本實驗涉及的引物，β-actin由Invitrogen公司設(shè)計，具體引物如下，見表3。

表2 PCR反應(yīng)混合液具體配置方法Tab.2 Specific configuration method of PCR reaction mixture

表3 引物列表Tab.3 List of primers

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計數(shù)據(jù)的分析，實驗數(shù)據(jù)用±s表示，統(tǒng)計學(xué)方法采用t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD1α陽性細(xì)胞在VLS中的表達(dá)CD1α陽性細(xì)胞光鏡下：在正常皮膚中平均（14.0±5.8）個，在早期VLS中平均（18.4±7.7）個，兩者無統(tǒng)計學(xué)上差異（P＞0.05）。在進(jìn)展期VLS中平均（28.6±3.2）個，與正常相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4、圖1。

表4 CD1α陽性細(xì)胞在VLS中的表達(dá)（±s）Tab.4 Expression of CD1αpositive cells in VLS（±s）

表4 CD1α陽性細(xì)胞在VLS中的表達(dá)（±s）Tab.4 Expression of CD1αpositive cells in VLS（±s）

Note：Compared with healthy vulvar skin，1）P＜0.05.

Number 14.0±5.8 18.4±7.7 28.6±3.21）Groups Healthy vulvar skin Early VLS Advanced VLS n 15 25 25

圖1 CD1α陽性細(xì)胞在VLS中的表達(dá)Fig.1 Expression of CD1α-positive cells in VLS

2.2 TLR2、IL-10 mRNA在VLS中的表達(dá)TLR2的mRNA表達(dá)量在早期VLS為1.34±1.27，與正常皮膚（1.65±0.84）相比無統(tǒng)計學(xué)上差異（P＞0.05）。但在進(jìn)展期為3.97±0.79，與正常相比有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異（P＜0.05）。IL-10的mRNA表達(dá)量在早期VLS中為1.09±0.89，與正常皮膚（1.08±0.36）相比無統(tǒng)計學(xué)上差異（P＞0.05）。在進(jìn)展期VLS為2.93±1.04，與正常相比有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異（P＜0.05，見表5）。

表5 TLR2和IL-10 mRNA的相對表達(dá)量（±s）Tab.5 Relative expressions levels of TLR2 and IL-10 mRNA（±s）

表5 TLR2和IL-10 mRNA的相對表達(dá)量（±s）Tab.5 Relative expressions levels of TLR2 and IL-10 mRNA（±s）

Note：Compared with healthy vulvar skin，1）P＜0.05.

IL-10 1.08±0.36 1.09±0.89 2.93±1.041）Groups Healthy vulvar skin Early VLS Advanced VLS TLR2 1.65±0.84 1.34±1.27 3.97±0.79

3 討論

目前病理學(xué)上將VLS分為兩種類型：早期和進(jìn)展期。早期可見棘層輕度不規(guī)則的增厚，真皮淺層水腫，大量的淋巴細(xì)胞浸潤，無明顯的均質(zhì)帶；進(jìn)展期可見表皮角質(zhì)層增厚，棘層細(xì)胞減少，基底細(xì)胞液化，真皮淺層膠原纖維變性形成均質(zhì)帶，其下伴有大量的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤［6］。兩種病理改變是否存在一個演變的過程，形成機制是否相同，尚不清楚。TLR屬于廣泛模式識別受體，是連接固有免疫與適應(yīng)性免疫的橋梁。TLR廣泛分布于多種細(xì)胞表面，但主要表達(dá)于和宿主防御功能有關(guān)的細(xì)胞，如單核巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。TLR識別內(nèi)外源性配體后可激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生，調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答［7］。TLR中TLR2表達(dá)范圍最廣，其胞外段可識別病原危險相關(guān)分子模式（PAMPS/DAMPS）分子。通過跨膜結(jié)構(gòu)將信號轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)由髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴信號傳導(dǎo)途徑和MyD88非依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生復(fù)雜的級聯(lián)信號反應(yīng)導(dǎo)致核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子活化，介導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌，參與免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)后天免疫功能的啟動。TLR2通過影響Th1和Th2的平衡，引起INFγ分泌的降低，IL-10分泌的相對升高，來抑制免疫反應(yīng)［4］。激活TLR-2可以促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生TLR-2依賴的IL-10，并促進(jìn)Treg細(xì)胞生成［8］。文獻(xiàn)報道TLR2/TLR1異質(zhì)二聚體是CD4+T細(xì)胞上的一種協(xié)同調(diào)控受體，在本課題組前期實驗中已檢測出CD45RO+T細(xì)胞（記憶性CD4+T細(xì)胞）在VLS中表達(dá)增加，且進(jìn)展期增加更明顯［7］。提示增多的CD4+T細(xì)胞表面的TLR2可能也增加，導(dǎo)致IL-10分泌增多。本研究的結(jié)果顯示VLS早期TLR2和IL-10 mRNA表達(dá)略增加，與正常外陰皮膚相比無統(tǒng)計學(xué)上的差異；而進(jìn)展期TLR2和IL-10 mRNA表達(dá)明顯高于正常，有統(tǒng)計學(xué)上差異。提示進(jìn)展期TLR2和IL-10 mRNA增加與CD4+T細(xì)胞增加有一定相關(guān)性。樹突狀細(xì)胞是皮膚中一種抗原提呈細(xì)胞，是啟動、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，可通過TLR-2通路被激活，從而釋放一些細(xì)胞因子如IL-10和TGF-β等。活化的樹突狀細(xì)胞極化Th0細(xì)胞至Treg細(xì)胞，顯示樹突狀細(xì)胞中TLR-2依賴的免疫調(diào)節(jié)功能［9］。本研究發(fā)現(xiàn)CD1α標(biāo)記的樹突狀細(xì)胞在VLS中表達(dá)增加，早期沒有統(tǒng)計學(xué)上差異，進(jìn)展期增加明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義。與TLR2和IL-10 mRNA在VLS中表達(dá)增加呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實進(jìn)展期TLR2和IL-10 mRNA增加與樹突狀細(xì)胞增多有一定的相關(guān)性。還有文獻(xiàn)報道：TLR2與巨噬細(xì)胞的結(jié)合被發(fā)現(xiàn)可以介導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生［9］。本課題組前期實驗中還檢測到VLS中CD68+細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）增多，進(jìn)展期增加更明顯，與早期相比有統(tǒng)計學(xué)上的差異［8］。本研究中TLR2和IL-10 mRNA在進(jìn)展期也增高，進(jìn)一步提示TLR2和IL-10 mRNA增加與巨噬細(xì)胞增多有一定相關(guān)性。綜上所述，在VLS進(jìn)展期CD4淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增加，可能促使其表面活化的TLR2增多，因此，以上細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10增加。IL-10是體內(nèi)重要的炎癥反應(yīng)抑制因子，通過下調(diào)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ等細(xì)胞因子及單核巨噬細(xì)胞上MHCⅡ類分子的表達(dá)，控制炎癥反應(yīng)的強度及抑制免疫反應(yīng)［10-11］。IL-10是CD4+CD25+Treg細(xì)胞的重要免疫調(diào)節(jié)因子，誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞增多，抑制免疫反應(yīng)，在VLS的早期IL-10無明顯增加，而進(jìn)展期IL-10明顯增多，與TLR2及其相關(guān)細(xì)胞增多有相關(guān)性［12］。進(jìn)一步提示在VLS進(jìn)展期存在免疫抑制現(xiàn)象。