微小RNA?191通過靶向調節TET1影響子宮內膜癌細胞的增殖和侵襲

李松 董莉麗 孫麗 李剛 袁爽 王學博 王克

南陽市中心醫院婦產科（河南南陽473000）

子宮內膜癌是一種具有較強侵襲和轉移能力的惡性腫瘤，在我國的發病率逐年增加，呈明顯的低齡化趨勢，治療后易復發，易產生化療耐藥性，尋找更為有效的策略用于子宮內膜癌的治療至關重要［1-2］。目前，基因靶向治療被認為是更精準和安全的治療方式，在惡性腫瘤的臨床治療中顯示出廣闊應用前景。微小RNA（microRNAs，miR?NAs）是指長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，主要通過與目的基因的3′非翻譯區（3′UTR）結合調控mRNA翻譯，可作為候選生物標志物用于疾病的診斷和治療［3-4］。

miR?191是一種高度保守的miRNA，在多種不同的癌癥類型中異常表達［5-6］。研究［7-9］證明，miR?191表達上調可促進肝癌、前列腺癌及胰腺癌的發展，是疾病預后不良的標志物。然而，miR?191在子宮內膜癌中的作用尚不明確。本研究檢測了miR?191在子宮內膜癌臨床樣本和人子宮內膜癌細胞中的表達差異，探討其對子宮內膜癌細胞生物學功能的影響及可能的作用機制，為臨床子宮內膜癌的基因治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 組織來源104例患者的新鮮子宮內膜癌組織及其癌旁組織來自本院2015年12月至2018年12月子宮內膜癌手術切除標本，已經過病理診斷證實，取材后立即放置于液氮中，然后保存在-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 細胞人子宮內膜癌Ishikawa、HEC?1?B、RL?952、JEC細胞株購自中科院上海細胞庫。細胞培養在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養條件為5% CO2、37℃。每2～3 d傳代一次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3 試劑DMEM培養基、胎牛血清、MTT染色試劑盒、Transwell小室、基質膠、結晶紫染液、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；LipofectaminTM2000（美國Invitrogen公司）；miR?191 inhibitor及其陰性對照、雙熒光素酶報告質粒pmirGLO均委托上海吉瑪公司構建；Rever?tAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo Scientific公司）；引物（日本TaKaRa公司）；TET1兔源單克隆抗體、羊抗兔二抗（Santa Cruz Biotechnol?ogy）。

1.4 方法

1.4.1 RT?PCR檢測子宮內膜癌組織及細胞miR?191及TET1的表達取子宮內膜癌組織、癌旁組織和Ishikawa、HEC?1?B、RL?952、JEC細胞，加入裂解液抽提總RNA，使用RevertAidTM first Strand cD?NA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物由日本Takara公司設計合成，所有樣品均以GAPDH為內參。反應體系：dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA模板2 μL+上下游引物分別1 μL，加去離子水至總體積25 μL。反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s、62℃退火30 s、72℃延伸30 s，重復40個循環，最后72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應，實驗重復3次。采用2?△△CT的方法計算目的基因mRNA相對表達水平變化。引物序列為：miR?191：5′?ACACTCCAGCTGGGCAACGGAATCCCAA?AAGC?3′；U6：5′?TTATGGGTCCTAGCCTGAC?3′；TET1：5′?CACTGCTTGCCTGGACTTCTG?3′，5′?CCC?AAAGAGCGGTTATCTTCTC?3′；GAPDH：5′?TGCTT?CACCACCTTCTTGA?3′，5′?TCACCATCTTCCAGGA?GC?3′。

1.4.2 細胞分組與轉染收集Ishikawa細胞，以4×105個/孔的濃度接種到6孔板。將細胞分為inhibitor組、NC組和對照組。當細胞生長融合至70%～80%時，參照LipofectaminTM2000試劑說明書，對inhibitor組細胞轉染miR?191 inhibitor，NC組細胞轉染miR?191 inhibitor NC，對照組細胞采用正常培養基培養。轉染5 h后更換為正常培養基，繼續培養48 h后檢測細胞miR?191和TET1 mRNA表達量，方法同1.4.1。

1.4.3 MTT法檢測細胞增殖能力轉染48 h后收集細胞，以3×103個/孔的濃度接種到96孔板，每組5個復孔，培養24、48、72 h后加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，37℃孵育4 h后棄上清，加入150 μL DMSO使結晶溶解，490 nm波長檢測吸光度（OD）值。

1.4.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力收集細胞，采用無血清培養基稀釋后以2×104個/孔接種于已鋪基質膠的Transwell上室，每孔200 μL，下室加入600 μL DMEM完全培養基，培養24 h后取出上室，甲醇固定20 min，擦掉上室殘余細胞，1%結晶紫染色15 min，PBS清洗后置于顯微鏡下觀察，選取4個高倍視野進行細胞計數，取平均值。

1.4.5 Western blot法檢測細胞TET1蛋白表達情況收集細胞提取蛋白，測定蛋白濃度，加入load?ing buffer混勻煮沸5 min使蛋白變性。配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS?PAGE電泳分離蛋白，然后電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入不同的一抗稀釋液，稀釋比例均為1∶1 000，4℃過夜，洗膜，滴加發光液，置凝膠成像系統顯影。

1.4.6 雙熒光素酶靶標實驗驗證miR?191與TET1的關系在TargetScan網站（http：//www.targetscan.org/vert_72/）檢索發現TET1是miR?191的潛在靶點，為檢測miR?191與TET1的靶向結合關系，設計與miR?191相結合的TET1的3′?UTR序列及其突變序列，將其構建到雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO上（此項工作委托上海吉瑪公司完成）。取Ishikawa細胞，按照5×104個/孔的密度接種到24孔板，待細胞融合到80%左右，向細胞轉染TET1?3′?UTR?NC/TET1?3′?UTR?WT/TET1?3′?UTR?MUT報告質粒、miR?191及對照miR?NC質粒進行共轉染，使用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性。

1.5 統計學方法應用SPSS 25.0軟件進行統計分析數據，實驗重復3次，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜癌組織及癌旁組織miR?191和TET1表達比較子宮內膜癌組織中miR?191表達量顯著高于癌旁組織，TET1 mRNA表達量顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05，圖1）。

圖1 子宮內膜癌組織及癌旁組織miR?191和TET1 mRNA表達比較Fig.1 Comparison of miR?191 and Tet1 mRNA expression in endometrial cancer tissue and adjacent tissues

2.2 子宮內膜癌細胞miR?191和TET1表達比較以JEC細胞為參照，miR?191在Ishikawa、HEC?1?B和RL?952細胞中的表達量分別為（85.62±1.35）、（20.68±1.98）、（1.88±0.88）（圖2A），TET1 mRNA的表達量分別為（0.07±0.01）、（0.30±0.02）、（0.62±0.04）（圖2B）。選擇miR?191高表達和TET1低表達的Ishikawa細胞株進行后續實驗。

圖2 子宮內膜癌細胞miR?191和TET1 mRNA表達比較Fig.2 Comparison of miR?191 and TET1 mRNA expression in endometrial cancer cells

2.3 抑制miR?191對TET1的表達水平的影響與對照組比較，NC組細胞miR?191和TET1表達無顯著變化（P>0.05）。與對照組和NC組比較，轉染miR?191 inhibitor使細胞miR?191表達降低，TET1表達升高，差異有統計學意義（P<0.05，圖3）。

圖3 抑制miR?191對TET1表達水平的影響Fig.3 Effect of miR?191 inhibition on TET1 expression

2.4 抑制miR?191對Ishikawa細胞增殖能力的影響培養24、48、72 h后，與對照組比較，NC組細胞的增殖能力無顯著變化（P>0.05）。與對照組和NC組比較，inhibitor組細胞的增殖能力顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05，圖4）。

圖4 抑制miR?191對Ishikawa細胞增殖能力的影響Fig.4 Effect of miR?191 inhibition on proliferation of Ishikawa cells

2.5 抑制miR?191對Ishikawa細胞侵襲能力的影響NC組與對照組細胞穿膜數量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。與對照組和NC組比較，inhibitor組細胞穿膜數量顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05，圖5）。

2.6 Western blot法檢測miR?191對Ishikawa細胞TET1表達的影響NC組細胞TET1蛋白表達與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。與對照組和NC組比較，inhibitor組細胞TET1蛋白表達增加，差異有統計學意義（P<0.05，圖6）。

圖5 抑制miR?191對Ishikawa細胞侵襲能力的影響Fig.5 Effect of miR?191 inhibition on invasion of Ishikawa cells

圖6 Western blot法檢測各組Ishikawa細胞TET1表達水平Fig.6 The expression of TET1 in Ishikawa cells was detected by Western blot

2.7 miR?191對TET1的靶向調控作用通過生物信息學網站對miR?191的靶基因進行預測和鑒定，TET1被預測為miR?191的結合位點（圖7A）。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，加入miR?191后，共轉染TET1?3′?UTR?WT的Ishikawa細胞中熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），共轉染TET1?3′?UTR?MUT和TET1?3′?UTR?NC的Ishikawa細胞中熒光素酶活性無顯著變化，差異無統計學意義（P>0.05，圖7B）。

3 討論

圖7 miR?191與TET1 3′UTR潛在結合點及熒光素酶活性Fig.7 Potential binding site and luciferase activity of 3′UTR of mir?191 and TET1

子宮內膜癌在我國的發病率逐年升高，尋找更有效的療法和靶標是當前子宮內膜癌臨床治療亟待解決的關鍵［10］。研究證明，成熟的miRNA可以通過3′?UTR、5′?UTR區域甚至mRNA編碼序列的不精確互補來調節靶基因的表達［11-13］。miR?191是一種高度保守的miRNA，最初在鼠類基因中被發現，后被證實在人類基因中也存在，在多種惡性腫瘤中呈高表達狀態，通過調控相應的靶基因促進癌細胞的增殖和侵襲［14-17］。然而，miR?191在子宮內膜癌中的作用尚不明確。

為探討miR?191對子宮內膜癌細胞生物學功能是否具有調控作用，本研究檢測了miR?191在子宮內膜癌及其癌旁組織中的表達差異。結果顯示，子宮內膜癌組織中miR?191的表達量顯著高于癌旁組織。同時，本研究檢測了Ishikawa、HEC?1?B、RL?952、JEC四種子宮內膜癌細胞中miR?191的表達差異，結果顯示，Ishikawa細胞中miR?191表達水平最高。向Ishikawa細胞轉染miR?191抑制物可降低細胞的增殖和侵襲活力，以上結果提示miR?191與子宮內膜癌細胞的生物學功能密切相關，抑制miR?191可直接影響子宮內膜癌細胞的增殖和侵襲能力。

為進一步探究miR?191對子宮內膜癌細胞的作用機制，本研究在TargetScan網站對miR?191的靶基因進行預測，檢索發現TET1是miR?191的潛在靶點。TET1基因是甲基胞嘧啶雙加氧酶家族的重要成員，能夠將5?甲基胞嘧啶氧化參與DNA去甲基化途徑，調控胚胎干細胞發育，并與神經系統、血液系統及腫瘤疾病的發生密切相關［18-19］。研究證明，上調TET1基因可抑制惡性腫瘤的轉移和侵襲，是腫瘤治療的潛在靶點［20-21］。猜測miR?191可能通過調節TET1影響子宮內膜癌發生和發展。

本研究發現，子宮內膜癌組織中TET1 mRNA的表達量顯著低于癌旁組織，在miR?191高表達的Ishikawa細胞中，TET1 mRNA的表達量最低。向Ishikawa細胞轉染miR?191抑制物后，TET1 mRNA的表達量升高，細胞的增殖和遷移能力降低。與上述結果一致，當Ishikawa細胞miR?191表達被下調后，TET1蛋白表達水平顯著增加，表明miR?191可能是通過調節TET1的表達改變子宮內膜癌細胞的生物學功能。為進一步證明miR?191對子宮內膜癌的作用是通過靶向TET1基因來調控的，采用雙熒光素酶靶標實驗驗證miR?191與TET1的關系，結果顯示，miR?191只能抑制野生型TET1?3′?UTR?WT Ishikawa細胞中的熒光素酶活性，而對突變型TET1?3′?UTR?MUT Ishikawa細胞中熒光素酶活性無影響，表明TET1是miR?191的潛在靶基因，miR?191對TET1基因的表達存在顯著的調控作用。

本研究探討了miR?191對子宮內膜癌細胞生物學功能的調控作用，并對其作用機制進行了初步探討，結果顯示miR?191在子宮內膜癌組織和子宮內膜癌Ishikawa細胞中高表達，能夠促進子宮內膜癌細胞的增殖和侵襲，這種作用可能是通過靶向抑制TET1的表達而實現的。然而本研究僅在細胞水平展開，實驗性質較為單一，未進行體內實驗驗證。本課題組下一步將在子宮內膜癌動物模型中探討miR?191的作用，為miR?191在子宮內膜癌中的作用提供理論依據。