白藜蘆醇通過上調SATB2促進HCT 116細胞Bax?Caspase3、9凋亡通路蛋白表達

都新新 張文琴 任彩佩 張一楠 孫要軍 崔香麗

山西醫科大學生理學系（太原030001）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種惡性腫瘤，在全世界范圍內發病率排名第三，病死率位居世界第二，其中發達國家結直腸癌發病率是發展中國家的三倍。最近十年，結直腸癌的發病率及病死率在包括中國在內的一些發展中國家都呈現上升趨勢［1］。早期結直腸癌可以通過手術切除治愈，但仍有復發的風險，而超過50%的病例確診即為晚期，除需要依靠化療藥物外［2］，手術后并發癥和藥物的不良反應，也讓術后患者生活質量嚴重下降［3］。因此尋找低毒又有效的預防和治療方法很有必要。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種天然的具有抗炎、抗癌、抗氧化作用的多酚類化合物，存在于紅葡萄等多種植物中。本實驗室前期研究表明白藜蘆醇通過食物給予可起到預防和治療腸炎相關結腸癌的作用，白藜蘆醇可以促進結腸癌上皮細胞凋亡，但其機制尚不明確［3］。

BCL?2家族蛋白（包括Bax、Bcl?2等）控制著細胞凋亡的一個關鍵點，即線粒體外膜通透性，它們能夠通過調控關鍵信號分子如細胞色素c（Cyto?chrome C，Cyt?C）的釋放啟動細胞凋亡。Cyt?C能促進Caspase?3、Caspase?9的活化，導致細胞凋亡從而抑制癌癥發展［4-8］。

近年來，許多研究發現結直腸癌的發生和發展與某些基因的表達異常有關，例如干擾ZEB1表達可抑制人結直腸癌細胞的增殖、遷移能力，增加細胞凋亡，抑制其上皮間質轉化［9］；一種富含AT序列的DNA結合蛋白（SATB2）是一種核基質相關蛋白，在生物發育、基因調控等過程中發揮重要作用，SATB2的異常調控已被發現與各種類型的癌癥高度相關［10］。因此本實驗選擇人結腸上皮細胞系HCT 116細胞作為研究對象，探究白藜蘆醇對SATB2蛋白表達的影響以及促進HCT 116細胞凋亡蛋白表達的機制。

1 材料與方法

1.1 材料人結腸癌細胞系HCT 116購自于中國科學院細胞庫，白藜蘆醇（純度≥99%）和DMSO購自美國sigma公司，SATB2 siRNA以及SATB2過表達質粒購自銳博生物公司，轉染試劑購自QIAGEN公司，Lip2000購自invitrogen公司，SATB2兔單克隆抗體、Bax兔單克隆抗體、Bcl?2兔單克隆抗體、Cytochrome C兔單克隆抗體、Caspase?9兔單克隆抗體購自美國abcam公司，Caspase?3兔多克隆抗體、β?actin鼠單克隆抗體、HRP山羊抗鼠IgG二抗購自武漢proteintech公司，HRP山羊抗兔IgG二抗購自北京全式金公司，脫脂奶粉購于CST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養采用含10%胎牛血清以及含1%雙抗的DMEM高糖培養基，于含有5%CO2的37℃恒溫培養箱中培養HCT 116細胞，細胞傳代一次后，取對數生長階段的細胞計數，并接種在六孔板上，接種24 h后，分別加入10 mg/mL的白藜蘆醇儲存液0、2、4、6、8 μL（體系中白藜蘆醇終濃度依次為0、8.33、16.67、25、33.33 μg/mL），繼續培養48 h后，收集細胞。

1.2.2 細胞轉染實驗取對數生長期的細胞接種在六孔板上。（1）SATB2敲低實驗：將細胞分為control組，si?SATB2組，Res組，si?SATB2+Res組。si?SATB2組 和si?SATB2+Res組 進 行 瞬 時 轉 染si?SATB2，24 h后，Res組、si?SATB2+Res組加入10 mg/mL的白藜蘆醇2 μL，十字搖勻放入培養箱繼續培養48 h。（2）SATB2過表達實驗：將細胞分為control組，空質粒組，SATB2過表達組，SATB2過表達+Res組。種板的細胞過夜貼壁后，用Lip2000轉染試劑進行質粒轉染，轉染24 h后，SATB2過表達+Res組加入2 μL 10 mg/mL的白藜蘆醇，十字搖勻，放入培養箱繼續培養48 h。

1.2.3 Western blot檢測蛋白的表達收集培養并轉染成功的細胞，加入含有1%PMSF的RIPA裂解液，超聲破碎細胞，離心后吸取上清，提取細胞總蛋白，BCA法測定提取的蛋白濃度，加入5X loading buffer和RIPA制備蛋白上樣液。制備好的蛋白上樣液按照上樣量20 μg進行SDS?PAGE凝膠電泳，電泳條件250 V，25 min，電泳結束后，室溫下半干轉法將凝膠上的蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉（0.25 g脫脂奶粉+5 mL TBST）封閉1.5 h，封閉結束后注入一抗室溫孵育1 h，然后4℃過夜，第2天回收一抗，TBST洗膜后室溫下二抗孵育1 h，再次TBST洗膜，利用ECL顯影液在Chemic?DocTMMP中顯影，利用Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學方法采用SPSS 23.0以及Origin 8.0軟件進行統計學分析，所有實驗結果的數據均重復3次以上，數據以均值±標準差的形式顯示，兩組之間采用獨立樣本t檢驗進行比較分析，多組之間采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Res上調HCT 116細胞SATB2蛋白的表達本實驗室前期實驗結果顯示Res能夠上調小鼠結腸組織中miR?31的表達，SATB2是miR?31作用的直接靶基因，因此本研究對HCT 116細胞給予Res 48 h處理。Western blot結果顯示，Res可上調HCT 116細胞中SATB2蛋白的表達（P<0.01），且隨著Res濃度升高而變化，Res濃度為8.33 μg/mL時，SATB2蛋白表達量最高，而Res濃度為16.67、25、33.33 μg/mL時，由于藥物劑量增加可能帶來的非特異性細胞毒性，細胞出現非正常死亡，HCT116細胞SATB2蛋白表達量反而逐漸降低［3］（圖1A、2A，表1）。SATB2過表達和敲低實驗中，其表達發生了相應的增高和下降，說明實驗方法成功。給予Res 8.33 μg/mL處理24 h后，SATB2蛋白比對照組顯著升高（P<0.05，圖1B、2B，表2）。

2.2 Res可逆轉SATB2抑制引起的Bax/Bcl?2比值下降為了探究SATB2對HCT 116細胞凋亡水平的作用以及Res對這種作用的影響，使用si?SATB2對細胞進行干擾，同時給予Res處理。Western blot結果顯示，與Control組相比較，用SATB2?siRNA進行干擾后，Bcl?2/Bax比值顯著升高（P<0.05）；單獨Res處理組的Bcl?2/Bax比值則顯著下降（P<0.05）；而SATB2?siRNA進行干擾并給予Res處理組的Bcl?2/Bax比值則差異無統計學意義（P<0.05）。說明抑制SATB2基因表達可抑制Bax表達，促進Bcl?2表達，導致Bcl?2/Bax比值上升，減少腸上皮細胞凋亡，而Res可以逆轉此作用。見圖2、表3。

圖1 HCT 116細胞SATB2蛋白的表達Fig.1 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells

圖2 不同濃度Res對SATB2蛋白表達的影響Fig.2 The effects of Res concentration on SATB2 expression

表1 不同濃度Res作用后SATB2表達Tab.1 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after treat with different concentrations of resveratrol±s

表1 不同濃度Res作用后SATB2表達Tab.1 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after treat with different concentrations of resveratrol±s

注：與Control組比較，**P<0.01；Res2組比較，##P<0.01

組別 例數SATB2 Control3 0.168 8±0.074 9 Res23 0.500 7±0.029 8**Res4 Res6 Res83 3 3 0.235 9±0.013 2##0.194 6±0,055 7##0.125 5±0.034 3##

表2 不同處理對SATB2表達的影響Tab.2 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression，knock?down in presence of resveratrol x±s

將SATB2過表達質粒轉入HCT116細胞后，同時給予Res處理，Western blot結果顯示，與Control組相比較，轉染空質粒組的Bcl?2/Bax比值并無顯著差異；轉染SATB2過表達質粒組Bcl?2/Bax比值下降（P<0.05）；而轉染SATB2過表達質粒同時給予Res處理組的Bcl?2/Bax比值下降更為顯著（P<0.05）。表明SATB2能夠促進Bax表達并且抑制Bcl?2表達，導致Bcl?2/Bax比值下降，Res則能夠加強這種作用，與Res增加SATB表達結果一致。見圖3，表3。

圖3 敲低SATB2同時給予Res處理后的Bax和Bcl?2蛋白表達Fig.3 Relative expression of Bax and Bcl?2 in HCT 116 cells after SATB2 knock?down in presence of resveratrol

圖4 過表達SATB2同時給予Res處理后的Bax和Bcl?2蛋白表達Fig.4 Relative expression of Bax and Bcl?2 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression in presence of resveratrol

表3 敲低或過表達SATB2同時給予Res處理后Bcl?2/Bax比值的變化Tab.3 Relative expression of Bcl?2/Bax Ratio in HCT 116 cells after SATB2 overexpression，knock?down in presence of resveratrol

2.3 Res激活Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路促進HCT 116細胞凋亡為了研究Res通過SATB2調控HCT 116細胞凋亡的機制，采用Western blot檢測轉染SATB2?siRNA以及SATB2過表達質粒同時給予Res處理的相關通路蛋白表達水平。結果顯示，與Control組相比較，轉染SATB2?siRNA后，HCT 116細胞的細胞色素C（Cyt?C）表達水平下降（P<0.01）；單獨給予Res處理組的Cyt?C表達水平則顯著升高（P<0.05）；而轉染SATB2?siRNA同時給予Res處理組的Cyt?C表達水平則與Control組差異無統計學意義（P<0.05，圖5A，表4）。此外檢測位于細胞凋亡通路下游的Caspase?3、Caspase?9蛋白的表達結果顯示，與Control組相比較，轉染SATB2?siRNA后，細胞的Caspase?3、Caspase?9蛋白表達水平均顯著下降（P<0.05）；單獨給予Res處理組的Caspase?3、Caspase?9蛋白表達水平則顯著升高（P<0.05）；而轉染SATB2?siRNA同時給予Res處理 組的Caspase?3、Caspase?9蛋 白 表達水平則差異無統計學意義（P<0.05，圖5B、C，表4）。以上結果表明抑制SATB2基因表達可抑制Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白的表達、抑制HCT 116細胞凋亡，而Res可以逆轉此作用。

表4 敲低SATB2同時給予Res處理后的Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白表達Tab.4 Relative expression of Cyt?C，Caspase?3，Caspase?9 in HCT 116 cells after SATB2 knock?down in presence of resveratrol

研究各組細胞蛋白表達水平在SATB2過表達情況下的差異Western blot結果顯示，與Control組相比較，轉染空質粒組的Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9表達水平差異無統計學意義；轉染SATB2過表達質粒組Cyt?C（P<0.01）、Caspase?3（P<0.05）、Cas?pase?9（P<0.05）表達水平明顯升高；而轉染SATB2過表達質粒同時給予Res處理組的Cyt?C（P<0.05）、Caspase?3（P<0.05）、Caspase?9（P<0.01）表達水平升高更為顯著。表明SATB2能夠促進Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白的表達，Res則可加強這種作用。見圖6，表5。

圖5 敲低SATB2同時給予Res處理后的Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白表達Fig.5 Relative expression of Cyt?C，Caspase?3，Caspase?9 in HCT 116 cells after SATB2 knock?downin presence of resveratrol

圖6 過表達SATB2同時給予Res處理后的Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白表達Fig.6 Relative expression of Cyt?C，Caspase?3，Caspase?9 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression in presence of resveratrol

3 討論

白藜蘆醇是一種在紅葡萄果皮中含量豐富的植物天然合成的非類黃酮多酚類物質，同時也是一種植物抗毒素，具有抗氧化特性［11］。早在21世紀初，就有研究報道白藜蘆醇對心血管系統具有保護作用，有助于控制動脈粥樣硬化、心臟病、關節炎和自身免疫性疾病。臨床試驗證明，白藜蘆醇在胃腸道中會被迅速吸收，繼而迅速代謝為葡萄糖醛酸苷和硫酸鹽，導致組織和血漿中白藜蘆醇濃度較低，但在對結直腸癌的研究中發現，低劑量的白藜蘆醇對結直腸癌仍有很好的效果［11-13］。白藜蘆醇能夠減輕結腸炎小鼠的炎癥癥狀，下調相關炎癥標志物的表達［14］。

表5 過表達SATB2同時給予Res處理后的Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白表達Tab.5 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression in presence of resveratrol ±s

表5 過表達SATB2同時給予Res處理后的Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白表達Tab.5 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression in presence of resveratrol ±s

注：與Control組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別Control pEXP?RB?Mam pEXP?RB?Mam?SATB2 pEXP?RB?Mam?SATB2+Res例數3 3 3 3 Cyt?C 0.472 4±0.098 5 0.485 1±0.070 9 0.973 2±0.103 1**1.352 6±0.431 6*例數3 3 3 3 Caspase?3 0.190 8±0.005 7 0.199 1±0.015 6 0.337 4±0.081 2*0.363 5±0.097 0*例數6 6 6 6 Caspase?9 0.396 7±0.006 5 0.418 4±0.006 5 0.704 7±0.120 1*0.793 6±0.099 9**

惡性腫瘤的發生具有異質性，炎癥、氧化應激和細胞凋亡等多種機制都可能參與了其發生和發展。而白藜蘆醇預防和治療動物腸炎相關腸癌的作用機制包括抗氧化、抗炎、誘導細胞凋亡和抗血管生成等作用［15］。有研究報道白藜蘆醇單獨或聯合用藥也能有效抑制HCT 116細胞中NF?κB信號通路，從而抑制癌細胞轉移達到抗結直腸癌的作用［16］。白藜蘆醇通過多種途徑抑制腫瘤，例如肖忠盛等［17］證實白藜蘆醇通過下調mTOR信號通路抑制結直腸癌細胞的增殖；白藜蘆醇可通過線粒體途徑促進人體鱗癌細胞凋亡，上調促凋亡蛋白Bax，下調抗凋亡蛋白Bcl?2，從而使細胞色素c從線粒體釋放到胞質當中，Caspase?9、Casapase?3被激活［18-20］，可有效抑制小鼠結腸腫瘤的產生［21］。本研究結果顯示經白藜蘆醇處理的HCT 116細胞，細胞色素c的表達量明顯上升，上游的Bax、Bcl?2蛋白以及下游的Caspase?3、9蛋白都相應發生變化，提示白藜蘆醇促進HCT116細胞凋亡的作用與Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路的激活有關。

作為一種潛在的抗腫瘤藥物，白藜蘆醇抗腫瘤作用的分子機制一直是研究的熱點。SATB2在許多類型的癌癥中都有異常轉錄，并且在不同的類型的細胞中，SATB2既可能是腫瘤抑制因子也可能是腫瘤促進因子。同時，SATB2也受很多分子的調控，如miR?31和miR?34a［10，22-24］。本研究結果證實白藜蘆醇對HCT 116細胞SATB2蛋白表達的上調作用。在敲低和過表達SATB2基因的情況下，觀察白藜蘆醇對HCT 116細胞經線粒體途徑凋亡作用的影響。結果顯示敲低SATB2后，HCT 116細胞中Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路各蛋白表達量下降，而白藜蘆醇可以一定程度的逆轉此作用；過表達SATB后，Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路蛋白表達上調，白藜蘆醇則能加強這種作用；表明白藜蘆醇促進Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路的作用與上調SATB2蛋白的表達有關。

綜上所述，本研究證實了白藜蘆醇能夠通過Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路促進HCT 116細胞凋亡，同時也能上調SATB2的表達。過表達SATB2基因能夠上調HCT 116細胞中Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路，表明白藜蘆醇促進HCT 116細胞經Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9途徑凋亡的作用與上調SATB2表達有關，為白藜蘆醇抗結直腸癌機制的研究提供了新的思路，但關于白藜蘆醇如何作用于SATB2以及SATB2影響凋亡通路的具體機制仍需進一步研究。