去甲斑蝥素增強人卵巢癌SKOV3 細胞對順鉑敏感性的機制研究

馮曉丹，毛 雪，王 英，董 秀*

（1.遼寧中醫藥大學中西醫結合學院，沈陽 110847；2.遼寧中醫藥大學中醫藥創新工程技術中心，沈陽 110847）

卵巢癌是一種具有復雜分子和基因變化的異質性疾病，由于其缺乏有效預防措施、篩查工具及無癥狀發展的特點，使其多在癌癥晚期才得以確診，且極易在根治性手術和化療后復發，故在婦科惡性腫瘤中病死率極高[1]。順鉑（cisplatin，DDP）是第一代鉑類抗癌藥物，對于包括卵巢癌在內的多種癌癥均有顯著的抗癌作用，臨床運用廣泛，但順鉑的內源性和獲得性耐藥極易造成患者后期療效不佳，增加復發風險，而對正常細胞過高的毒副作用，也限制了順鉑的臨床用藥，故順鉑與其他抗癌藥物聯合治療已成為許多癌癥的新治療策略[2]。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是蟲類中藥提取物斑蝥素的衍生物，是近年來抗癌藥物的新起之秀，其多靶點、增強免疫反應[3]、逆轉耐藥[4]等優勢，是與順鉑聯合用藥的較好選擇。本實驗將應用流式細胞分析、熒光染色和Western blot 方法檢測去甲斑蝥素能否增強順鉑對卵巢癌SKOV3 細胞敏感性，為臨床用藥提供新的治療策略和依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 人卵巢癌細胞株（SKOV3）購于中科院上海細胞庫去甲斑蝥素（N8784）；順鉑（貨號：P4394-25MG）（美國Sigma 公司）；胎牛血清（FBS）、PBS 磷酸鹽緩沖液、RPMI-1640 培養液（美國Hyclone 公司）；MTT（貨號：M8180），二甲基亞砜DMSO（貨號：D8372），SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（貨號：P1200），普通RIPA 裂解液（組織/細胞）（貨號：R0020），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：PC0020）購于北京索萊寶科技有限公司；Annexin-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（KC0001）購于ImmunoWay Biotechnology；Mito-Tracker Green（線粒體綠色熒光探針）（貨號：C1048）購于中國碧云天生物技術有限公司。

1.2 細胞培養方法 將人卵巢癌細胞珠SKOV3 接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液的細胞瓶中，放入5% CO2、37 ℃的二氧化碳培養箱培養，在培養過程中觀察細胞形態、生長狀態和細胞數量，及時換液、傳代，適時進行凍存，保留實驗備用。

1.3 MTT 法檢測聯合用藥對SKOV3 細胞活性的影響 將細胞消化，制成單細胞懸液，計數后按2 000 個/孔，200 uL/孔接種于96 孔培養板內。次日，按正常對照組、去甲斑蝥素30 μmol/L 組，順鉑10 μg/mL組、去甲斑蝥素30 μmol/L+順鉑10 μg/mL 組依次加藥，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h，48 h，72 h。取出96孔培養板，避光下，每孔加入MTT 工作液25 uL，繼續培養4 h。吸出孔中培養液，每孔加入DMSO 150 uL，搖床上震蕩10 min，用酶標儀在490 nm 測定其吸光度值。抑制率（%）=（A490對照-A490給藥）/（A490對照-A490空白）× 100%

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 將SKOV3 卵巢癌的單細胞懸液以5×105個細胞/孔的密度接種于6 孔細胞板中培養。次日，待細胞貼壁后按1.3 進行分組加藥，計時至指定時間，將原細胞培養液吸出保留，用特定胰蛋白酶（不含EDTA）消化，加入保留的原培養液吹打，用以制成細胞懸液。將細胞懸液以1 000 r/min離心5 min，棄上清，加PBS重懸計數。離心，以400 μL Binding Buffer 懸浮細胞，細胞密度為每毫升1×106個。加入5 μL 的Annexin V-FITC 結合液，4 ℃，避光，15 min。加入10 μL 的PI 染色液，4 ℃，避光，5 min。室溫下放搖床上震蕩避光孵育15 min，而后用流式細胞儀進行檢測。

1.5 熒光顯微鏡觀察細胞線粒體形態變化和分布 取對數生長期的SKOV3 細胞，經洗滌、消化后按照每孔400 μL 細胞懸液約8 000 個細胞接種48 孔板。次日，按1.3 加藥處理，每孔給藥400 μL。在藥物作用指定時間后吸出原培養液，加入提前37 ℃預溫培育的終濃度為200 nM 的Mito-Tracker Green 工作液，培養箱避光孵育40 min，去除Mito-Tracker Green 工作溶液，加入37 ℃預溫培育的新細胞培養液，在熒光顯微鏡下進行觀察、拍照、記錄。

1.6 免疫印跡法檢測蛋白表達 將細胞懸液以濃度5×105個細胞/皿接種于細胞培養皿中，放入培養箱培養。次日，按1.3 分組加藥，藥物作用指定時間后，在冰上經PBS 淋洗、裂解液裂解后提取蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性后凍存待用。將變性的等量蛋白加入SDS-PAGE 凝膠孔中。用12% SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白質，分離完畢后以濕轉的方式將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上。將膜放入5%的脫脂牛奶中，室溫封閉1 h，TBST 清洗2 次，加入一抗孵育，放置4 ℃冰箱中，孵育過夜。次日，用TBST洗膜4 次，每次10 min，添加二抗，室溫孵育1 h 。加入ECL 發光液后曝光，掃描記錄圖像。

1.7 統計學方法 采用 SPSS 22.0 統計學軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（）表示。各組間數據比較應用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 去甲斑蝥素聯合順鉑對卵巢癌細胞的生長抑制作用 分別加入去甲斑蝥素（30 μmol/L）、順鉑（10 μg/mL）和去甲斑蝥素（30 μmol/L）+順鉑（10 μg/mL）作用于卵巢癌細胞，分別于24、48、72 h 檢測藥物誘導的細胞毒性作用。如圖1 所示，去甲斑蝥素和順鉑聯合用藥后，去甲斑蝥素可有效提高卵巢癌細胞對順鉑的敏感性，在24 h 的生長抑制作用最為理想。

圖1 NCTD 聯合順鉑對卵巢癌細胞的生長抑制作用

2.2 去甲斑蝥素聯合順鉑對卵巢癌細胞凋亡的影響 流式細胞術結果顯示，在早期凋亡中，去甲斑蝥素能明顯增強順鉑誘導卵巢癌細胞凋亡作用。相較于去甲斑蝥素（30 μmol/L）、順鉑（10 μg/mL）單獨用藥組，去甲斑蝥素與順鉑聯合用藥組（30 μmol/L+10 μg/mL）的細胞凋亡率明顯升高。見圖2，圖3。

圖2 去甲斑蝥素聯合順鉑用藥的流式分析結果

圖3 去甲斑蝥素聯合順鉑用藥對細胞凋亡的影響（，n =3）

2.3 去甲斑蝥素聯合順鉑對卵巢癌細胞線粒體形態的改變 在用Mito-Tracker Green 特異性標記去甲斑蝥素（30 μmol/L）、順鉑（10 μg/mL）和去甲斑蝥素+順鉑（30 μmol/L+10 μg/mL）用藥后卵巢癌細胞中的線粒體發現，與正常對照組細胞中線粒體形態相比，去甲斑蝥素（30 μmol/L）與順鉑（10 μg/mL）單獨用藥組出現少部分呈點塊狀形態的線粒體，而去甲斑蝥素與順鉑聯合用藥組細胞中點塊狀線粒體數量明顯增加，聚集分布于核周，具有顯著差異性，提示去甲斑蝥素促進了順鉑對卵巢癌細胞線粒體形態的改變，見圖4。

2.4 去甲斑蝥素與順鉑聯合用藥對卵巢癌細胞中procaspase-3 蛋白表達的影響 通過蛋白免疫印跡的方法檢測用藥后卵巢癌細胞中procaspase-3 蛋白表達，發現與正常對照組比較，在去甲斑蝥素（30 μmol/L）與順鉑（10 μg/mL）組中均出現不同程度的procaspase-3蛋白表達下降，而去甲斑蝥素與順鉑（30 μmol/L+10 μg/mL）聯合用藥組中procaspase-3 蛋白表達下降程度增加，見圖5。

圖4 去甲斑蝥素聯合順鉑對卵巢癌細胞線粒體形態的改變（線粒體熒光染色）

圖5 去甲斑蝥素聯合順鉑用藥對procaspse-3 表達的影響

3 討論

隨著醫學技術的進步，有了更好的手術技術和更多的化療方案，但臨床目前使用的對卵巢癌一線化療反應良好的鉑類化合物和紫杉烷類藥物，仍會在大多數患者中出現復發和化療耐藥現象[5]。探索改善一線治療藥物療效和化療藥物后期療效的方法勢在必行。凋亡是指在多種基因調控下細胞主動死亡的過程[6-8]，在清除不穩定基因或異常生長的細胞方面中起著至關重要的作用，是機體發育和維持體內平衡的重要途徑。通常，癌癥的發生多與癌細胞避開凋亡這一程序性死亡途徑相關[9]，故抗癌藥物多是通過誘導腫瘤細胞凋亡、縮小瘤體實現抗癌的目的[10-12]。去甲斑蝥素是蟲類中藥斑蝥提取物斑蝥素的衍生物，對于多種癌細胞均有顯著的抑制作用。去甲斑蝥素誘導腫瘤細胞凋亡的方式有多種，既可以觸發線粒體途徑誘導黑色素瘤[13]、人前列腺癌[14]和胃癌[15]細胞凋亡，又可以引發內質網應激誘導人腎癌[16]細胞凋亡。實驗[17]證明去甲斑蝥素能通過抑制c-met 蛋白的表達逆轉肺癌細胞A549/DDP 細胞對順鉑耐藥，增強了肺癌細胞對順鉑的敏感性。

本課題組前期實驗旨在驗證去甲斑蝥素對卵巢癌SKOV3 細胞的抑制作用，當去甲斑蝥素作用于卵巢癌細胞后可使促凋亡蛋白 Bax 表達水平上升，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達水平下調以及procaspase-3 的表達降低，同時還可以通過介導卵巢癌細胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生引起G2/M 期的調控因子p21 蛋白表達上調和cyclin B1 蛋白表達下調，調控細胞周期，誘導卵巢癌細胞凋亡[18]。本研究發現，去甲斑蝥素能有效促進順鉑誘導卵巢癌細胞凋亡，抑制細胞活性。這一結果與郭紀偉等[19]在去甲斑蝥素作用于肺癌細胞實驗中結果相同，即去甲斑蝥素增強了腫瘤細胞對順鉑的敏感性。在用Mito-Tracker Green 線粒體綠色熒光探針染色實驗中，去甲斑蝥素和順鉑聯合用藥可明顯破壞細胞內線粒體形態，可能與去甲斑蝥素作用于卵巢癌細胞后ROS 水平升高，Bax/ Bcl-2 比率上調誘發線粒體損傷相關。在既往的研究中顯示，高水平的ROS 可以引發線粒體損傷，介導線粒體凋亡途徑的，ROS 可引發線粒體膜通透性轉運孔開放，進而引起線粒體跨膜電位降低，釋放細胞色素C，引發Caspase 的級聯反應，誘導腫瘤凋亡[20]。Bax/Bcl-2 比率上調可以引發線粒體膜電位崩潰，釋放細胞色素C，活化Caspase 引發級聯反應[21-22]。故可從以上2 個方面，對去甲斑蝥素聯合順鉑用藥損傷卵巢癌細胞線粒體機制進行后續實驗補充證明。

Caspase 家族在細胞凋亡的起始和執行中都發揮重要作用，其中就包含第一個被信號激活的啟動者Caspase（Caspase-2，-8，-9 和-10）和執行凋亡任務的執行者Caspase（Caspase-3，-6 和-7），許多傳統的癌癥療法都是通過間接激活這些Caspases 來誘導細胞凋亡以清除癌細胞[23-24]。研究顯示在大多腫瘤細胞中，如淋巴瘤、白血病等，由于凋亡被抑制，凋亡的執行者Caspase-3 的酶原procaspase-3，會在腫瘤中出現過表達的現象，通常Caspase-3是以procaspase-3的形式存在，只有在接受到凋亡信號時才會被活化為Caspase-3 執行凋亡指令[25-26]。本實驗免疫印跡結果顯示與對照組相比，去甲斑蝥素、順鉑組均可減少細胞內procaspase-3蛋白的表達，順鉑和去甲斑蝥素聯合用藥顯著降低了細胞內procaspase-3 蛋白的表達，抑制了腫瘤的發生，提示聯合用藥后藥物可能依賴Caspase 途徑誘導卵巢癌細胞凋亡。

綜上所述，去甲斑蝥素在卵巢癌的體外實驗中，可促進順鉑對卵巢癌細胞的抑制作用，為臨床去甲斑蝥素輔助順鉑治療卵巢癌提供了新的理論依據和研究方向。