日本血吸蟲表膜蛋白SjOST48 DNA疫苗的免疫保護作用研究①

譚 瀟 肖楚麗 肖 非 王 碩 （邵陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，邵陽422000）

日本血吸蟲（Schistosoma japonicum，SJ）是一種嚴(yán)重危害人類健康的人畜共患寄生蟲病，可導(dǎo)致肝、腸組織損傷，形成病理性蟲卵肉芽腫和繼發(fā)性肝纖維化［1-2］。雖然吡喹酮能有效治療血吸蟲病感染，但無法控制患者重復(fù)感染［3］。因此，疫苗研究依然是防控血吸蟲病長期有效的策略。目前血吸蟲病的疫苗研究主要經(jīng)歷了滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗等，而且已經(jīng)篩選出多種疫苗候選分子［3-6］。但是其免疫保護性并沒有得到實際的臨床應(yīng)用。日本血吸蟲病表膜蛋白（oligo‐saccharide transferase，SjOST48）是一種二磷酸寡糖轉(zhuǎn)移酶，能夠通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜催化高甘露糖型寡糖，進而參與鋅蛋白質(zhì)N-連接糖基化修飾過程［7-8］。目前這類蛋白質(zhì)主要存在于外膜蛋白、分泌型蛋白和體液蛋白中，通常作為診斷抗原和治療靶標(biāo)［8］。LIU等［7］證實血吸蟲重組表膜蛋白OST48具有較好的免疫原性，并且對血吸蟲的生長發(fā)育具有重要作用，同時在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了部分免疫保護作用。盡管如此，SjOST48重組蛋白作為免疫保護性抗原仍然存在一定問題，主要體現(xiàn)在免疫效力較弱，持續(xù)時間較短等。DNA疫苗作為一種新的疫苗接種策略主要是通過肌肉注射將質(zhì)粒DNA注入到肌肉細胞中，從而誘導(dǎo)長期的體液和細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)［9-10］。血吸蟲病表膜蛋白OST48蛋白的DNA疫苗研究尚未報道。因此，本研究通過構(gòu)建表膜蛋白OST48的DNA疫苗，肌肉注射到BALA/c小鼠，評估其免疫應(yīng)答類型和抗血吸蟲病感染的免疫保護效果，以期為血吸蟲病臨床疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 DNA質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司；6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自湖南斯萊克景達有限公司（SCXK湘2016-0002）；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；Goat anti-mouse IgG、IgG1、IgG2a二抗購自Abcam公司；Mouse TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10 ELISA試劑盒購自eBioscience公司；CCK-8試劑盒購自Dojindo公司；HeLa細胞、大腸桿菌E.coliBL21、血吸蟲尾蚴的陽性釘螺和真核質(zhì)粒pcDNA3.1（+）由南華大學(xué)病原生物研究所惠贈。

1.2 方法

1.2.1 OST48真核載體構(gòu)建方法 依據(jù)參考文獻［7］設(shè)計血吸蟲病表膜蛋白OST48蛋白引物（上游引物：5′-GAAGAGCTCGAGGACAAGCGGAAAAAT-3′，下游引物：5′-GCGCTCGAGTTATTCACCCTTTTCT-3′），通過PCR擴增將OST48基因序列連接到pcDNA3.1（+）質(zhì)粒上。將構(gòu)建成功的真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coilJM 109中培養(yǎng)，凝膠電泳鑒定成功后送至上海生工公司進行測序。

1.2.2 重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞 將成功提取的質(zhì)粒pcDNA3.1/SjOST48通過Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至HeLa細胞。48 h后加入蛋白裂解液，冰上孵育30 min，離心（4℃，13 000/rmin，15 min），收集細胞蛋白，Western blot檢測pcDNA3.1/SjOST48在HeLa細胞中的表達情況。

1.2.3 動物免疫實驗 6～8周齡雌性BALB/c小鼠（100只）隨機分為5組：PBS組、pcDNA3.1（+）組、FA組、SjOST48重組蛋白組和pcDNA3.1/SjOST48組。每隔2周小鼠左后腿股四頭肌肌肉注射相對應(yīng)質(zhì)粒100μg或者等劑量PBS并尾部靜脈收集血清，共免疫3次，末次免疫2周后無菌分離小鼠脾淋巴細胞。本研究所有動物均得到邵陽學(xué)院動物福利審查委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：SYXK2015-0001）。

1.2.4 血清抗體檢測 ELISA法檢測各階段免疫小鼠血清抗體水平，將SjOST48重組蛋白稀釋后加入96孔ELISA檢測板中［10μg/(ml·孔）］，4℃ 過夜。將不同時間收集的小鼠血清倍比稀釋（1：100）后作為一抗加入至96孔板中孵育2 h（37℃），每孔100μl。HRP標(biāo)記的goat anti-mouse IgG、IgG1、IgG2a作為二抗（1：1 000）孵育1.5 h（37℃）。最后于450 nm處測定各孔OD值。

1.2.5 CCK-8法檢測脾淋巴細胞增殖情況 將無菌分離的脾淋巴細胞以2×105個/孔接種于96孔板中。SjOST48重組蛋白（10μg/ml）刺激細胞。培養(yǎng)48 h（37℃，5%CO2）后每孔加入CCK-8溶液（10μl）繼續(xù)培養(yǎng)4 h（37℃，5%CO2）后，于酶標(biāo)儀450 nm處測定各組OD值。刺激指數(shù)（SI）=（刺激組OD值-空白組OD值）/（未刺激組OD值-空白組OD值）。

1.2.6 ELISA法檢測脾淋巴細胞上清中的細胞因子 同法將收集的小鼠脾淋巴細胞以2×105個/ml加入24孔板中。SjOST48重組蛋白（10μg/ml）刺激細胞72 h后收集細胞上清，并按照細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10試劑盒說明書檢測各免疫小鼠的細胞因子水平。

1.2.7 肝組織病理切片 末次免疫2周后血吸蟲尾蚴感染小鼠，感染后6周麻醉處死小鼠，無菌分離肝臟組織后進行HE染色和Masson染色，顯微鏡下觀察肝臟組織病理改變。采用UVP成像系統(tǒng)記錄100倍視野中10個肉芽腫的面積。

1.2.8 小鼠肝臟減卵率計算 將上述無菌分離的肝臟組織（0.5 g）剪碎，溶于5%KOH溶液37℃水浴5 h，收集懸液（500μl），顯微鏡下計數(shù)蟲卵數(shù)。肝臟減卵率（%）=（對照組平均肝蟲卵數(shù)-免疫組平均肝蟲卵數(shù)）/（對照組平均肝蟲卵數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad 5.0進行統(tǒng)計學(xué)分析?？贵w水平、刺激指數(shù)、細胞因子水平以及肝臟減卵率等數(shù)據(jù)均以±s表示，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（Oneway-ANOVA）。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1/SjOST48真核質(zhì)粒載體構(gòu)建和在HeLa細胞中表達 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SjOST48的菌液PCR鑒定結(jié)果顯示在1 248 bp處出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期大小一致（圖1A），并且測序結(jié)果與SjOST48基因序列一致（圖1B）。將構(gòu)建成功的真核質(zhì)粒pcDNA3.1/SjOST48轉(zhuǎn)染HeLa細胞后進行Western blot分析。結(jié)果顯示在50 kD出現(xiàn)明顯條帶（圖1C），說明pcDNA3.1/SjOST48重組質(zhì)粒能夠在真核細胞內(nèi)穩(wěn)定表達。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Sj OST48的PCR與Western blot鑒定Fig.1 PCR and Western blot identification of recombi?nant plasmid pcDNA3.1/SjOST48

圖2 免疫小鼠血清IgG以及IgG亞類水平Fig.2 Levels of serum IgG and IgG subclass in immu?nized mice

2.2 免疫小鼠血清中IgG及其亞類IgG1、IgG2a分泌水平 為了驗證pcDNA3.1/SjOST48是否在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)一定水平的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，通過檢測不同時期血清中的抗SjOST48特異性抗體反應(yīng)，其結(jié)果顯示：免疫第2周即產(chǎn)生SjOST48特異性抗體，隨后抗體水平逐漸增加，并在第8周達到最大（1：25 600）（P＜0.05）（圖2A）。 此 外 ，pcDNA3.1/SjOST48同樣能夠增強小鼠血清中IgG1、IgG2a分泌水平，且IgG2a/IgG1的比值均大于1（圖2B）。

2.3 免疫小鼠脾淋巴細胞增殖水平 CCK-8法檢測各實驗組小鼠脾淋巴細胞增殖水平，圖3所示，末次免疫2周后，pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠的脾淋巴細胞增殖指數(shù)（5.94±2.34）明顯高于對照組（P＜0.05）。

2.4 免疫小鼠脾淋巴細胞上清中細胞因子含量 圖4結(jié)果顯示pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠脾淋巴細胞上清中TNF-α、IL-10和IFN-γ含量顯著增加（P＜0.05）。與此相反的是IL-4的分泌水平與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。進一步證明了pcD‐NA3.1/SjOST48能誘導(dǎo)Th1型細胞免疫反應(yīng)。

2.5 HE染色法檢測小鼠肝臟病理變化及蟲卵數(shù)量 為了檢測pcDNA3.1/SjOST48是否能提供保護性免疫，控制血吸蟲病的感染，我們對血吸蟲感染后小鼠的肝臟進行病理切片分析（圖5）。結(jié)果顯示，pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠的肝臟肉芽腫體積明顯小于PBS組及SjOST48重組蛋白組，并且肉芽腫的數(shù)量也明顯少于對照組；pcDNA3.1/SjOST48組的肝臟炎癥浸潤情況較對照組明顯減輕，只有少量的嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤；通過對蟲卵數(shù)量的計數(shù)發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠的肝臟蟲卵數(shù)量也明顯少于對照組（表1），表明pcDNA3.1/SjOST48能顯著增強SjOST48的免疫保護作用，有效控制血吸蟲病的感染。

圖3 免疫小鼠脾淋巴細胞增殖水平Fig.3 Level of lymphocyte proliferation in immunized mice

圖4 免疫小鼠脾細胞上清細胞因子檢測Fig.4 Levels of cytokines in spleen cell supernatant of im?munized mice

表1 各組小鼠減蟲率及肝組織減卵率（±s，n=15）Tab.1 Worm and egg reduction rates of mice in each group（±s，n=15）

表1 各組小鼠減蟲率及肝組織減卵率（±s，n=15）Tab.1 Worm and egg reduction rates of mice in each group（±s，n=15）

Note：Compared with control group（PBSand pcDNA 3.1），1）P＜0.05.

GroupsWorm burdenWormreductionAveragenumber of eggsLiver egg rate（%）per gram liver tissue（×104）reduction rate（%）PBS26.63±3.41-36.86±6.25- pcDNA3.125.83±2.45-36.32±4.31- FA25.31±3.62-35.61±3.56-SjOST4820.36±2.1523.541）28.63±3.6522.331）pcDNA3.1/SjOST4818.06±1.2111.301）23.67±2.5435.781）

圖5 各組小鼠肝臟病理變化（HE染色，×40）Fig.5 Histopathological changes in the liver after Schisto?soma japonicum infection in mice（HE，×40）

3 討論

目前國內(nèi)臨床上針對血吸蟲病的感染主要以抗生素治療為主，但是重復(fù)感染病例依然很嚴(yán)重，單靠藥物治療并不能有效控制血吸蟲病傳播［3，13］。因此，疫苗研究依然是防控血吸蟲病傳播的首選策略。LIU等［7］證實SjOST48蛋白主要位于血吸蟲表膜，并且作為寡糖轉(zhuǎn)移酶，在血吸蟲蟲卵生殖和病理損傷方面發(fā)揮著重要作用。同時在小鼠體內(nèi)也能誘導(dǎo)一定水平的免疫原性和免疫保護性。然而，這種重組抗原的免疫原性往往較差，而且不能產(chǎn)生免疫保護所需的免疫應(yīng)答類型，限制了其在臨床中的應(yīng)用。DNA疫苗能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液和細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，目前已用于多種傳染病動物模型的保護性研究［9，14］。而本研究通過構(gòu)建SjOST48 DNA疫苗來增強其免疫保護性效果，以期能在血吸蟲病疫苗的研制中提供理論基礎(chǔ)。

本次實驗中我們同樣證實了SjOST48重組蛋白具有一定的保護性，能控制血吸蟲病的感染，但是其免疫保護效果并不理想。而血吸蟲疫苗產(chǎn)生的體液免疫在抗血吸蟲病過程中發(fā)揮的作用并不明顯，相反長期的保護性免疫主要依賴于Th1型細胞免疫反應(yīng)［4，15］。檢測抗體亞類結(jié)果顯示，pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠血清中IgG2a/IgG1的比值均大于1，表明SjOST48的DNA疫苗能誘導(dǎo)Th1型細胞免疫反應(yīng)。以往研究證明，Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)參與了血吸蟲病的免疫病理損傷，能夠促進組織肉芽腫形成［12，16］。 此 次 實 驗 中pcDNA3.1/SjOST48誘 導(dǎo) 的Th1型細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)抑制了Th2型細胞免疫，因此減輕了血吸蟲病肝臟的病理損傷，相較于重組SjOST48蛋白，DNA疫苗的免疫保護性更加明顯。研究表明Th1型細胞因子介導(dǎo)的免疫保護性是血吸蟲病清除的主要機制［11-12］。LIU等［17］發(fā)現(xiàn)Th1型細胞因子TNF-α能夠募集大量的炎癥細胞介導(dǎo)肉芽腫形成而清除蟲卵。TNF-α主要是由單核細胞和巨噬細胞等先天免疫細胞分泌的細胞因子［18］。而pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠脾淋巴細胞上清中存在大量的TNF-α，因此說明SjOST48 DNA疫苗可能激發(fā)了先天免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而促進宿主早期清除血吸蟲病感染。也有文獻指出血吸蟲病患者血清中能檢測到大量Th1型細胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10），并且也證實這些細胞因子參與宿主體內(nèi)血吸蟲清除［15］。而pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠體內(nèi)INF-γ、IL-10和TNF-α的大量分泌以及IL-4分泌水平無統(tǒng)計學(xué)意義，進一步說明SjOST48 DNA疫苗能誘導(dǎo)Th1型細胞免疫反應(yīng)。INF-γ是早期清除血吸蟲病感染最主要的Th1型細胞因子，能夠活化T淋巴細胞和巨噬細胞［11］。本研究中，pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠肝臟的病理切片中肉芽腫數(shù)量及面積明顯少于對照組。說明SjOST48 DNA疫苗誘導(dǎo)的Th1型細胞免疫保護性明顯優(yōu)于重組蛋白SjOST48。DNA疫苗雖然能同時誘導(dǎo)體液和細胞免疫，產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答反應(yīng)，但其免疫應(yīng)答強度和穩(wěn)定性受多方面的影響［19］。佐劑一直是疫苗研究的熱點，和重組抗原一樣，DNA疫苗也能通過佐劑增強免疫效果和穩(wěn)定性。因此，在未來研究中我們將重點探索SjOST48 DNA疫苗的佐劑篩選。

綜上所述，SjOST48 DNA疫苗能夠誘導(dǎo)高水平的特異性SjOST48抗體，并且能誘導(dǎo)Th1型細胞免疫應(yīng)答，顯著增強其抗血吸蟲病感染的保護作用，為研制預(yù)防和控制抗血吸蟲病感染的DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。但是DNA疫苗免疫原性和穩(wěn)定性的多方面影響仍然需要我們對其免疫保護機制進行更為深入的研究。