2-脫氧-D-葡萄糖通過誘導人非小細胞肺癌細胞線粒體功能障礙抑制腫瘤細胞增殖①

胡先華 趙春艷 張海迪 陳書志 母 波 （川北醫學院醫學檢驗系，南充637000）

癌癥是威脅我國乃至全球人類健康的重大疾病，其發病率和致死率居各類慢性疾病之首［1］。然而，癌癥作為一種長久以來存在的惡性疾病，一直難以攻克，這源于惡性腫瘤細胞獨有的特征，包括不間斷的生長信號刺激、強勁的自我復制能力、持續的血管生成、組織浸潤和轉移能力、逃避免疫系統的監控、細胞代謝異常、基因組的不穩定性和突變等［2］。其中，能量代謝的異常在近年來受到學界的廣泛關注［3］。

腫瘤的發生發展和細胞代謝異常密切相關［4］。德國生化和生理學家OTTO WARBURG早在20世紀20年代就提出了著名的“Warburg效應”：即使有足夠的氧氣供應，腫瘤細胞仍偏好于借助糖酵解途徑而不是能產生更多ATP的線粒體氧化磷酸化方式產生能量滿足快速生長的需求［5］。

2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）能競爭性地抑制葡萄糖轉運體1和己糖激酶介導的磷酸化，其產生的6-磷酸2DG（2DG-6-phosphate，2DG-6P）聚集在細胞內無法被代謝利用，且半衰期長達50 min，2DG-6P通過競爭性抑制磷酸葡萄糖異構酶抑制6-磷酸葡萄糖轉化為6-磷酸果糖，阻斷糖酵解于起始階段，從而發揮抗腫瘤效應［6］。糖酵解途徑一直是腫瘤靶向的目標，而2-DG作為一種糖酵解抑制劑應用于腫瘤治療方面的研究。目前研究表明2-DG能增強阿霉素和紫杉醇的抗腫瘤活性，和組蛋白脫乙酰酶抑制劑具有協同效應［7］；2-DG與阿霉素或l-丁硫氨酸磺酰亞胺協同作用，可減少乳腺癌細胞的黏附和遷移，但是對于靶向抑制線粒體還鮮有報道［8］。

本研究旨在通過2-DG作用于非小細胞肺癌細胞后的一系列生物學行為改變來探討線粒體在腫瘤發展中所發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 非小細胞肺癌細胞A549由川北醫學院醫學影像研究保存并傳代。DMEM培養基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、青霉素鏈霉素購自HyClone公司；2-DG購自美國Sigma公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A549細胞用含10%FBS、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM完全培養基，置于37℃、5%CO2的條件下培養，當細胞融合度達80%～90%時用0.25%胰蛋白酶按1：3消化傳代，取對數生長期的細胞進行實驗操作。

1.2.2 CCK-8試驗 A549細胞以5×103個/孔接種于96孔板，培養24 h后更換新鮮培養基，并加入不同濃度的2-DG繼續培養48 h，棄去培養基，每孔加入10μl CCK-8試劑，37℃ 孵育2 h，450 nm波長處測定吸光度值（A），計算細胞抑制率。

1.2.3 細胞凋亡試驗 A549細胞接種于6孔板，培養24 h后更換新鮮培養基，加入不同濃度2-DG培養48 h后，重懸細胞后離心棄上清，按說明書分別加入Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液，室溫避光孵育20 min，最后用流式細胞儀測定。

1.2.4 細胞周期試驗 A549細胞接種于6孔板，培養24 h后更換新鮮培養基，加入不同濃度2-DG培養48 h后，PBS重懸細胞，離心棄上清，70%乙醇固定2 h以上，再次重懸細胞，加入碘化丙啶染色液37℃避光溫浴30 min，最后用流式細胞儀測定。

1.2.5 線粒體膜電位測定（JC-1） A549細胞接種于6孔板，培養24 h后更換新鮮培養基，加入2-DG培養48 h后，按說明書加入JC-1工作液，37℃孵育20 min，后續步驟按試劑盒說明書進行，最后用流式細胞儀分析。

1.2.6 線粒體基因組測定 不同濃度的2-DG處理A549細胞后，對對照組和處理組細胞進行高通量測序，對比其線粒體基因組變化情況。

1.3 統計學方法 應用GraphPad Prism5.0統計軟件對實驗數據進行統計學分析，組間以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2 -DG抑制非小細胞肺癌細胞A549增殖 分別用濃度為25μmo/lL、50μmo/lL、100μmo/lL、1 mmo/lL、10 mmo/lL的2-DG處理A549細胞48 h后，計算細胞抑制率，結果如圖1所示。結果顯示，作用48 h后，各濃度2-DG均可明顯抑制A549細胞增殖，且隨著藥物濃度增大，A549細胞抑制率逐漸增大，其IC50約為10 mmo/lL。

2.2 2 -DG作用于A549細胞后凋亡測定 2-DG作用于A549細胞48 h后，流式細胞術檢測腫瘤細胞凋亡結果如圖2所示，2-DG對非小細胞肺癌細胞A549的凋亡抑制不明顯。

2.3 2 -DG作用于A549細胞后周期測定 與對照組相比，不同濃度2-DG作用于A549細胞48 h后細胞周期均有所改變，且隨著2-DG濃度增大，細胞周期更多阻滯在S期（圖3、表1）。

圖1 不同濃度2-DG作用A549細胞48 h后細胞抑制率Fig.1 Cell inhibition rate of A549 treated with 2-DG at different concentrations for 48 h

圖2 不同濃度2-DG作用A549細胞48 h后細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of A549 treated with 2-DG at different concentrations for 48 h

圖3 不同濃度2-DG作用A549細胞48 h后細胞周期情況Fig.3 Cell cycle of A549 treated with 2-DG at different concentrations for 48 h

2.4 線粒體膜電位測定結果 如4所示，2-DG作用于A549細胞后，細胞群發生偏移，A549細胞膜電位從高到低，說明2-DG可誘導A549細胞的線粒體膜損傷。

表1 不同濃度2-DG作用A549細胞48 h后細胞周期情況Tab.1 Cell cycle of A549 treated with 2-DG at different concentrations for 48 h

圖4 不同濃度2-DG作用A549細胞48 h后線粒體膜電位（JC-1）變化情況Fig.4 Changes of mitochondrial membrane potential（JC-1）in A549atdifferentconcentrationsof 2-DGfor 48h

2.5 線粒體基因組測定結果 測序結果如圖5所示，經2-DG處理后的細胞線粒體基因組結構與對照組相比無明顯變異。本研究中的高通量數據Q30＞95%（表2），且Amplicon覆蓋均一性高（圖6），表明本次測序質量的可信度高。

圖5 2-DG處理A549細胞后線粒體突變頻率Fig.5 Mitochondrial mutation frequency of A549 treated with 2-DG

表2 2-DG處理A549細胞后線粒體測序質量值QTab.2 Mitochondrial sequencing quality value Q of A549 treated with 2-DG

圖6 高通量測序Amplicon覆蓋均一性Fig.6 Coverage uniformity of high-throughput sequenc?ing Amplicon

3 討論

線粒體被稱為細胞的能量屋，在細胞生理學中發揮重要作用。真核細胞中，大部分細胞能量（ATP）是在線粒體中通過氧化磷酸化過程產生的，但腫瘤細胞卻以產能效率更低的糖酵解方式獲取能量，提示在腫瘤的發生發展過程中，線粒體氧化磷酸化途徑的作用很可能被嚴重削弱［9］。研究證實，糖酵解和線粒體呼吸作用的失衡增強了腫瘤細胞對低氧環境的適應，有利于腫瘤的發生發展進程［10］。此外，糖酵解途徑導致的乳酸增加還可分解破壞腫瘤細胞周圍的細胞基質，促進腫瘤細胞遷移［11］。因此，在腫瘤的發展過程中，糖酵解是其主要的供能方式。

在氧化呼吸過程中，線粒體電子傳遞鏈通過一系列氧化還原反應將所產生的能量以電化學勢能儲存于線粒體內膜，造成內膜兩側質子及其他離子濃度的不對稱分布從而產生電化學梯度，形成線粒體膜電位（mitochondrial membranepotential，MMP）［12］。正常的MMP是維持線粒體進行氧化磷酸化的先決條件，MMP的穩定有利于維持細胞的正常生理功能，也是評價線粒體功能完整性的關鍵參數。線粒體功能障礙、線粒體膜損傷、線粒體電子傳遞鏈異常等均可能導致MMP發生改變。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。JC-1有單體和多聚體兩種形式存在，當膜電位較高時，形成發射紅色熒光的多聚體，當凋亡發生即膜電位較低時，形成發射綠色熒光的單體形式，故而可以通過細胞群的偏移來檢測線粒體膜電位的變化。

另外，研究發現多種腫瘤表現出線粒體DNA變異，其變異可導致氧化磷酸化功能受到抑制，活性氧物質增加，促使腫瘤細胞在不利條件下依然能夠生長。由于線粒體DNA參與編碼有氧呼吸的關鍵組成部分—呼吸鏈的多個復合體，因此，與細胞核DNA相比，線粒體DNA缺乏組蛋白，且對DNA的修復能力較弱。由藥物刺激引起的腫瘤細胞的氧化應激反應可能導致線粒體DNA在轉錄水平發生異常［13］。同時，腫瘤細胞中線粒體DNA發生突變的頻率較高，這些突變也可能引起線粒體功能異常［14］。

WARBURG曾假設，線粒體呼吸鏈的破壞是腫瘤細胞糖酵解增強的重要原因［18］。由于線粒體基因組編碼了呼吸鏈中13個重要的蛋白組分，且線粒體DNA在腫瘤細胞中存在高頻突變［19］。例如，在前列腺癌、結直腸癌等多種癌癥中均可觀察到線粒體DNA突變［20-21］。推測線粒體DNA的突變很可能影響其所編碼蛋白的功能并影響呼吸鏈。

2-DG作為糖酵解抑制劑，在多種腫瘤中均表現出抗腫瘤活性。研究表明其可通過干預N連接糖基化，導致內質網內非正常蛋白質折疊反應，繼而誘發內質網應激［15］。ZAGORODNA等［16］在淋巴瘤細胞的研究中表明，2DG誘導內質網應激，繼而激活Bcl-2相互作用細胞死亡介導因子，通過對Bcl-2家族促凋亡蛋白的調控誘導細胞凋亡。程秀等［17］的研究顯示，2-DG對乳腺癌細胞的增殖具有抑制作用，但其本身并不誘導細胞凋亡，而是通過明顯增加臨床乳腺癌常用治療藥物的療效來誘導乳腺癌細胞凋亡，其機制可能是通過誘導細胞產生過度的ER應激反應，增強Caspase-3活性而發揮作用。本研究著眼于經2-DG作用之后的非小細胞肺癌細胞的行為學改變是否與線粒體DNA突變有關，并期望找到線粒體DNA的突變模式及其作用機制。

由CCK-8結果可知，經不同濃度的2-DG刺激后，A549細胞的增殖活性受到抑制，且隨著藥物濃度的增大，細胞生長抑制率逐漸增高，說明2-DG可有效抑制非小細胞肺癌細胞的增殖活性。然而，流式細胞術結果表明，在不同濃度2-DG的刺激下，A549細胞的凋亡并未明顯增強，而隨著2-DG濃度增大，A549細胞周期阻滯在S期，說明高濃度的2-DG刺激可有效抑制細胞周期進程，從而阻斷腫瘤細胞增殖。

有研究顯示，線粒體功能障礙與腫瘤的發生發展密切相關，化療誘導的低水平線粒體DNA與腫瘤細胞獲得性耐藥和抗凋亡特性有關［22-24］。LIjIE‐MA［22］等研究了非小細胞肺癌（NSCLC）多藥耐藥的原因，發現線粒體DNA突變與NSCLC腫瘤發生發展有關，但與其多藥耐藥能力無關，另外，乳酸和ROS生成的差異提示線粒體功能障礙參與了NSCLC的多藥耐藥。因此，線粒體功能障礙可能是腫瘤細胞發展迅速的重要因素之一，線粒體功能障礙導致線粒體呼吸鏈的破壞或減弱，腫瘤細胞糖酵解得以增強。

本研究也測定了經2-DG處理后A549細胞的線粒體基因組序列，與對照組相比，線粒體基因組序列并未有所改變。然而JC-1結果顯示，隨著2-DG濃度的增加，細胞群發生偏移，線粒體膜電位（MMP）由高到低發生改變，說明2-DG誘導A549細胞線粒體膜發生損傷。結果表明，在2-DG的刺激下，A549細胞線粒體膜受到損傷，但并未導致基因組結構的破壞。

4 結論

本研究顯示，2-DG能有效抑制非小細胞肺癌細胞A549的增殖活性，線粒體基因組檢測并未發現細胞線粒體DNA突變，因此，2-DG對非小細胞肺癌的抑制作用可能并不是通過誘導DNA突變導致線粒體結構異常來實現的。推測2-DG可能主要作用于A549細胞的線粒體，通過誘導線粒體膜損傷，使線粒體功能發生障礙，進一步誘導細胞周期阻滯，從而抑制腫瘤細胞生長。然而，該的推測需要佐證，其具體作用途徑尚需進一步研究。