miR-10a、miR-21聯合預測老年重癥膿毒癥患者的病死率

嚴憲才 吳志光 劉錦文 周耀輝 劉俊鋒 陳子良 （中山市中醫院急診科，中山528400）

膿毒癥是指有明確感染的全身炎癥反應綜合征，發病率較高，且以每年1.5%～8.0%的速度增長，病死率在37.4%～46.5%［1］。重癥膿毒癥表現為伴有器官功能障礙和/或組織灌注不足，若病情短期內得不到有效逆轉，患者最終會因多臟器功能障礙死亡［2］。老年人機體功能退化，免疫力降低，抵御疾病能力較弱，老年重度膿毒病患者28 d病死率相對較高［3］。因此尋找預測老年重度膿毒病患者28 d病死風險的生物標志物，提前調整治療方案，對降低患者病死率意義重大。微小RNA（microRNA，miRNA）已被證實與人體組織的代謝、炎癥反應以及膿毒癥的發生發展有著不可分割的聯系［4］。微小RNA-10a（microRNA-10a，miR-10a）作為miRNA中的重要類型，參與炎癥、免疫應答反應等多種生物學過程［5］。微小RNA-21（microRNA-21，miR-21）據報道是一種抗凋亡因子，與膿毒癥的急性腎損傷有關，影響患者生存期［6］。但miR-10a、miR-21在28 d病死與生存的老年重癥膿毒癥患者中的表達差異和其預測價值尚不清楚，因此本研究通過對比研究老年重癥膿毒癥患者外周血miR-10a、miR-21水平與老年重癥膿毒癥患者28 d病死率之間的關系，探究二者聯合對老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的預測效能。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 回顧分析2017年6月至2019年10月于本院接受治療的102例老年重癥膿毒癥患者的臨床資料，其中男性55例，女性47例，年齡60～78歲，平均年齡（63.12±11.04）歲，身體質量指數（body mass index，BMI）15.26～27.65 kg/m2，平 均BMI（21.66±3.85）kg/m2。治療措施：血管活性物質干預24例，體外肺膜支持20例，連續性血液凈化35例，機械通氣輔助通氣27例，使用糖皮質激素19例。原發感染部位：肺或呼吸道感染20例，泌尿系統感染26例，腹腔感染10例，中樞系統感染9例，血液感染25例，外科傷口感染5例，膽道感染7例。合并癥：合并糖尿病15例，高血壓24例，心肌損傷10例，燒傷4例，肝損傷10例，其中合并2項及以上7例。

1.1.2 納入標準 ①具有明確的感染，臨床癥狀和化驗結果均符合膿毒癥的診斷標準［7］；②合并出現器官功能障礙如：嚴重急性呼吸綜合征（acute re‐spiratory distress syndrome，ARDS）、心功能不全、應激性潰瘍、急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）、肝功能不全等；③年齡≥60歲；④臨床資料完整并同意調閱研究。

1.1.3 排除標準 ①處于瀕死狀態；②非細菌感染；③器官移植、非獲得性免疫缺陷癥、惡性腫瘤；④肝臟、腎臟、心臟疾病處于終末期；⑤妊娠或哺乳。

1.2 方法

1.2.1 分組 患者確診后28 d內是否死亡為標準，將102例納入標準的研究對象分為2組，其中確診后28 d內死亡患者為死亡組，確診后28 d未發生死亡的患者為生存組。

1.2.2 檢測外周血miR-10a、miR-21 所有患者于入院當天采取清晨空腹外周靜脈血6 ml置于含有肝素無菌抗凝管（20 U/ml），密度梯度離心法分離外周血中單個核細胞，使用RNA提取試劑盒提取外周血單個核細胞中總RNA，利用UV-5800H型紫外分光光度計檢測總RNA純度，采用逆轉錄試劑盒將總RNA轉錄為模板鏈cDNA。采用CFX96型熒光定量PCR儀進行qRT-PCR，反應體系共10μl：miS‐cript SYBR?Green Mix 5μl，cDNA（50 ng/μl）1μl，上下游引物（10μmo/lL）各0.5μl，ddH2O 3.0μl。反應條件：95℃90 s，95℃30 s，63℃30 s，72℃15 s，45個循環，每個樣品均設3個平行反應。采用2-??Ct法對血清miR-10a、miR-21表達水平進行定量分析。miR-10a、miR-21及內參U6的引物序列見表1。

1.2.3 影響老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的危險因素分析 將所有可能影響老人重癥膿毒癥患者確診后28 d內死亡的影響因素歸納整理：性別、BMI、C反應蛋白（C-reaction protein，CRP）、血清乳酸、急性生理學和慢性健康狀況評分系統Ⅱ評分［8］（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ）、維生素D（vitamin，VitD）、治療措施、原發病、合并癥、miR-10a、miR-21，將其作為自變量（X）并賦值，賦值結果見表2，確診后28 d內發生死亡記為1，未發生死亡記為0，分析影響老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的危險因素。

1.2.4 觀察指標 ①分析影響老年重癥膿毒癥患者28 d內死亡的影響因素及比值比（OR）；②評估miR-10a、miR-21對老年重癥膿毒癥患者28 d內死亡的預測價值。

1.3 統計學方法 采用統計學軟件SPSS20.0進行數據分析，計數資料采用“例/率”表示，行χ2檢驗，若理論頻數在1～5之間，采用校正χ2檢驗；計量資料采用±s表示，行t檢驗；Logistic回歸分析影響老年重癥膿毒癥患者28 d病死的危險因素；Pearson法分析患者APACHEⅡ評分與外周血miR-10a和miR-21的相關性；受試者工作特征ROC曲線評估外周血miR-10a和miR-21表達水平預測老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2 組患者外周血miR-10a、miR-21表達水平比較 所有研究對象確診后28 d內死亡患者29例（死亡組），存活患者73例（存活組），28 d病死率為28.43%。入院時死亡組外周血miR-10a、miR-21表達水平顯著高于存活組（P＜0.05），見表3。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

表2 老年重癥膿毒癥患者28 d病死率自變量賦值表Tab.2 Independent variable assignment of mortality rate in 28 d in elderly patients with severe sepsis

表3 2組外周血miR-10a、miR-21表達水平比較（xˉ±s）Tab.3 Comparison of expression levels of miR-10a and miR-21 in peripheral blood between two groups（xˉ ±s）

2.2 2 組不同臨床特征患者28 d死亡率對比 死亡組APACHEⅡ評分≥20分患者構成比顯著高于存活組（P＜0.05），2組患者在CRP、血清乳酸、VitD水平和外周血miR-10a、miR-21表達水平分布上有差異（P＜0.05），其中死亡組CRP≥40 mg/L、血清乳酸≥3 mmo/lL、VitD＜20 ng/ml、miR-10a表達水平≥1.31、miR-21表達水平≥2.39者構成比顯著高于存活組（P＜0.05），見表4。

2.3 Logistic回歸分析 經過Logistic回歸分析可知，APACHEⅡ評分≥20分、CRP≥40 mg/ml、血清乳酸≥3 mmo/lL、外周血miR-10a表達水平≥1.31、外周血miR-21表達水平≥2.39是老年重癥膿毒癥患者28 d病 死 的 獨 立 危 險 因 素（OR=5.842、4.328、3.554、1.645、4.031），VitD＞26 ng/ml是老年重癥膿毒癥28 d病死的保護因素（OR=0.321），見表5。

2.4 APACHEⅡ評分與外周血miR-10a、miR-21的相關性分析 Pearson分析發現，APACHEⅡ評分與外周血miR-10a、miR-21無相關性（r=0.317、0.309，P=0.085、0.142）。

2.5 miR-10a、miR-21及聯合對老年重癥膿毒癥患者28 d死亡率的預測價值 根據外周血miR-10a、miR-21表達水平及二者聯合預測老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的ROC曲線（圖1）可知，外周血miR-10a、miR-21表達水平的最佳截斷點為1.68、1.81，靈敏度分別為93.10%、82.75%、96.55%，特異度分別為73.97%、84.93%、90.41%，AUC分別為0.863、0.893、0.920，見表6。

表4 2組不同臨床特征患者28 d死亡率對比[n,(%）]Tab.4 Comparison of 28 d mortality of patients with different clinical characteristicsin group 2[n,(%）]

表5 Logistic回歸分析Tab.5 Logistic regression analysis

表6 miR-10a、miR-21及聯合對老年重癥膿毒癥患者28 d死亡率的預測價值Tab.6 Predictive value of miR-10a，miR-21 and their combination on 28 d mortality in elderly patients with severe sepsis

圖1 miR-10a、miR-21及聯合預測ROC曲線Fig.1 Curve of miR-10a，miR-21 and combination pre?diction ROC

3 討論

miRNA在人體中的表達異常可引起某些疾病的發生和發展［11-12］。miRNA不僅與腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡有關，還參與異常的機體免疫應答和炎癥反應過程［13］。膿毒癥是由感染引起的全身性炎癥反應，嚴重時患者器官發生衰竭，病情兇險，死亡率高，因此迫切需要生物標志物預測老年重癥膿毒癥患者28 d病死率，協助判斷預后。既往研究證明，miR-21與膿毒癥的發病和進展相關，但是有關miR-10a在膿毒癥患者中的表達研究鮮有，同時二者與老年重癥膿毒癥患者28 d死亡率之間的關系尚未闡明，是否可以作為預測其預后的標志物，是一項值得探討的課題［14］。

本研究發現，患者28 d病死率為28.43%，入院時死亡組外周血miR-10a、miR-21表達水平顯著高于存活組，說明外周血miR-10a、miR-21的高表達與老年重癥膿毒癥28 d病死率有關，外周血miR-10a、miR-21表達水平影響患者病情發展。霍銳等［9］研究發現，膿毒癥所致腎損傷患者28 d病死率為35.53%，本研究與之有一定差距，可能由于本研究所選研究對象高齡、發展到嚴重時期時已確診為膿毒癥的原因使其成為重點防護對象，治療更確切，從而病并且還發現死亡患者血清中miR-10a-5p表達水平升高，本研究與之一致，說明外周血中miR-10a水平對膿毒癥患者28 d病死率影響較大。WANG等［15］發現膿毒癥患者體內miR-21表達升高，且經過體外細胞培養發現miR-21升高直接加重腎小球的濾過屏障功能的損傷，說明miR-21的高表達可能與膿毒癥患者的病情有關。

本研究中經Logistic回歸分析發現，外周血miR-10a表達水平≥1.31、外周血miR-21表達水平≥2.39、APACHEⅡ 評分≥20分、CRP≥40 mg/ml、血清乳酸≥3 mmo/lL是老年重癥膿毒癥患者28 d病死的獨立危險因素，VitD＞26 ng/ml是老年重癥膿毒癥28 d病死的保護因素。研究報道［16］，APACHEⅡ評分是膿毒癥患者28 d死亡的獨立危險因素，APACHEⅡ評分≥19.5分的膿毒癥患者，28 d病死率顯著上升，說明病情越嚴重患者死亡風險越高，需在患者入院治療時及時進行APACHEⅡ評分，根據其是否存在高病死風險，及時采取有效干預措施。同時，臨床上高齡（一般認為≥70歲）患者通常合并基礎病較多，多器官功能障礙，免疫力低下，患病期間的病死率也相應上升，因此年齡≥70歲的患者應注意全面治療，避免手術干預［17］。CRP可以避免淋巴細胞過度活化，代償性降低炎癥反應對機體的損傷，CRP含量升高，表明機體炎癥反應較高［18］。覃小蘭等［19］研究報道，CRP是老年肺部感染致膿毒癥患者28 d死亡的危險因素，提示應及時觀測CRP水平，做好防治工作。據報道［20］，感染風險增加與VitD缺乏有關，VitD可作用于T細胞抑制由Th17介導的炎癥反應，提高重癥膿毒癥患者25（OH）D3的利用度，減輕炎癥反應，降低死亡風險。陳隆旺等［21］研究發現，膿毒癥致病過程中miR-10a表達上調，抑制miR-10a的表達可以顯著提高調節T細胞的比例，促進免疫功能，說明異常升高的miR-10a可能通過抑制機體免疫功能加快膿毒癥病情的發展，導致患者病死率上升。miR-21對人體有免疫調控功能，miR-21過表達會抑制TLR4信號通路，抑制機體免疫功能甚至免疫麻痹，最終導致患者死亡，提示外周血miR-21的過表達可能是導致老年重癥膿毒癥患者28 d病死率升高的原因［22］。

另外，本研究中APACHEⅡ評分與外周血miR-10a、miR-21無相關性，證實相互獨立。外周血miR-10a、miR-21聯合預測老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的特異度、AUC均高于單獨預測，且靈敏度與單獨預測相近，提示二者聯合預測老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的價值更高。綜上所述，確診后28 d病死的老年重癥膿毒癥患者外周血miR-10a、miR-21表達水平異常升高，與老年重癥膿毒癥患者28 d病死率有關，APACHEⅡ評分≥20分、CRP≥40 mg/ml、血清乳酸≥3mmo/lL、外周血miR-10a表達水平≥1.68、外周血miR-21表達水平≥1.81的老年重癥膿毒癥患者28 d病死風險增加，VitD≥26 ng/ml老年重癥膿毒癥患者28 d病死風險降低，miR-10a聯合miR-21用于預測老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的效果較好，可作為預測其28 d病死率的有效標志物。