基于蛋白質相互作用網絡的茶樹抗假眼小綠葉蟬研究

王 芬，裴會敏，文 狄，陳 志，李 靜

（黔南民族師范學院生物科學與農學院，貴州 都勻 558000）

0 引言

【研究意義】假眼小綠葉蟬（Empoasca vitis Gothe）屬葉蟬科，是小綠葉蟬的優勢種群，也是茶葉的主要害蟲之一[1,2]，其成蟲和若蟲刺吸為害茶樹新梢、嫩葉，嚴重影響茶葉的產量和品質[3,4]。該蟲1年可發生9～13代，蟲態混雜，世代重疊。通常在5～6月份、9～10月份形成2個蟲口高峰[5,6]，廣泛分布于浙江、福建、貴州、海南、云南、安徽等茶區，一般可致夏、秋茶損失20%左右[7]，目前主要以物理、化學和生物方法進行防治。通過構建被假眼小綠葉蟬侵染和未侵染的茶樹差異基因蛋白質相互作用網絡（PPIN）[8?10]，探尋差異基因參與的信號通路發生改變的分子機制，為培育良種茶苗提供理論依據。【前人研究進展】蛋白質是茶葉的重要組成成分，占茶鮮葉干物質的20%～30%[11?13]。茶樹在抵抗害蟲脅迫時往往會表現出抗蟲性狀，合成大量的脅迫誘導蛋白[14]。如何增強茶樹生長適應性，提高抗寒、抗旱、抗病等能力，已日益成為茶樹栽培生產和品種選育中亟待解決的問題。杜鵑[15]研究了平陽特早茶樹在Pb脅迫下，接種根內球囊菌和未接種的茶樹葉片中蛋白組差異，對茶樹Pb脅迫的進一步探究提供了重要的線索。朱俊慶等[16,17]通過不同茶樹品種對假眼小綠葉蟬抗性的研究發現，嫩葉柵狀組織和嫩莖皮層越厚，抗蟲性越強。還有研究者從茶小綠葉蟬侵染烏龍茶和鐵觀音前后茶樹的揮發物組成和含量都發生較大的變化的角度，來研究茶樹的抗蟲性[18]。此外，有研究通過外源MeSA誘導，發現茶樹應對假眼小綠葉蟬的取食行為通過產生防御蛋白來抵抗外界的侵害[19]。另外，有研究人員通過分析假眼小綠葉蟬取食嫩葉后的CsRIP1和CsRIP2表達情況，來研究茶樹防衛反應[20]在植物與害蟲相互作用機理方面，大多數植物在受到害蟲侵害時，將通過改變體內蛋白質的表達來完成信號的感應和傳遞，從而引起植物相應的反應，研究相關蛋白質有利于更好地了解生物體應對害蟲侵害時的分子機制。【本研究切入點】假眼小綠葉蟬對茶樹的危害的應對方式目前研究得還不夠深入，因此，亟須構建茶樹的蛋白質相互作用網絡來探究侵害的分子機理。【擬解決的關鍵問題】本研究通過對有無受假眼小綠葉蟬侵害的都勻毛尖茶樹鳥王種進行轉錄組測序，基于同源比對算法構建0 h與12 h、0 h與24 h的差異基因蛋白質相互作用網絡，在蛋白質相互作用網絡的基礎上研究茶樹抵御假眼小綠葉蟬侵害，為都勻毛尖病蟲害防治、保證都勻毛尖產品質量和產量，對地方社會經濟的可持續發展具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

茶葉選用黔南民族師范學院大棚培養的都勻毛尖茶樹鳥王種扦插苗，假眼小綠葉蟬取自黔南州都勻市螺絲殼茶園。

1.2 假眼小綠葉蟬侵染茶苗

選取9盆長勢一致的茶苗分別放在3個封閉良好的紗網籠子中，分別標記為0 h、12 h和24 h。8月份將從茶園捉來的4齡假眼小綠葉蟬在第2個籠子和第3個籠子各放50只，第1個籠子不放。假眼小綠葉蟬取食0 h、12 h和24 h后，分別在3個籠子中進行采樣，每個時間點設置3個生物學重復。取樣時要選擇長勢一致相同葉位的嫩葉，置于－80℃冰箱保存，之后送往北京百邁客生物科技有限公司進行轉錄組測序。

1.3 差異基因蛋白質相互作用網絡構建

將二代得到的轉錄本與安徽農業大學宛曉春團隊的中國種茶樹基因組[21]進行序列比對，并分析0 h與12 h，0 h與24 h的差異基因，運用同源比對的方法將差異基因與STRING數據庫[22]進行比對，利用Cytoscape 3.3.0[23]將比對上的差異基因進行蛋白質相互作用網絡的構建，最后通過GO和KEGG對蛋白質相互作用網絡進行注釋。

2.1 網絡構建

分別取假眼小綠葉蟬侵染0 h、12 h和24 h的鳥王種嫩葉進行轉錄組測序，根據不同樣品的基因表達量篩選0 h與12 h、0 h與24 h的差異表達基因，并利用同源比對和SRTING數據庫構建差異基因蛋白質相互作用網絡（表1、圖1），圖中紅色的菱形和紫色的V形代表相互作用數目最多的蛋白，可能是網絡中的關鍵節點，如果將關鍵節點去除，整個網絡就會癱瘓，因此，關鍵節點在網絡中具有重要的 作用。

表 1 差異基因相互作用數目Table 1 Number of PPIs in DEGs

圖 1 侵染0 h和侵染24 h差異基因蛋白質相互作用網絡Fig. 1 PPINs of DEGs between 0 h and 24 h after infestation

2.2 差異蛋白功能預測

通過差異基因的蛋白質相互作用網絡可以預測關鍵蛋白和蛋白質的功能，如果已知一個蛋白質的功能，那么與這個蛋白相連接的其他蛋白可能具有類似的功能。在假眼小綠葉蟬侵染0 h與12 h的差異基因蛋白相互作用網絡中共212個互作，其中

TEA027317、TEA020609、TEA009850、TEA015801、TEA007831、TEA002561、TEA007510和TEA010299是連接度最大的8個蛋白，即可能為關鍵蛋白。通過GO和KEGG注釋，發現TEA027317是rac樣GTP結合蛋白ARAC7，具有GTP酶活性，參與脫落酸激活信號通路和GTP酶介導的信號傳導。與其互作的蛋白有19個，由此可以推出這19個蛋白也可能具有類似的功能。TEA002561、TEA010299、TEA000210、TEA010470的互作主要參與DNA復制、堿基切除修復、核酸切除修復、錯配修復。TEA000833、TEA030826、TEA027049的相互作用涉及植物激素信號轉導。TEA012289與亞油酸和亞麻酸代謝相關。因此，在假眼小綠葉蟬侵染茶葉的過程中，茶樹通過各種蛋白互作啟動相應通路來應對假眼小綠葉蟬的侵害。

在假眼小綠葉蟬侵染都勻毛尖葉片0 h和24 h的差異基因蛋白質相互作用網絡中共有3 551個互作，TEA019056、TEA009394、TEA027713、TEA003559、TEA021407、TEA022367、TEA027317、TEA009850、TEA020609和TEA015585是度最大的10個蛋白，也是網絡中最重要的蛋白。TEA019056是周期蛋白依賴性激酶，具有ATP結合活性，與之相連的蛋白有139個，也可能具有類似的功能。對相互作用的蛋白進行GO和KEGG分析，TEA002561、TEA010299、TEA026104、TEA018073、TEA029227、TEA006566、TEA031297、TEA005054、Camellia_sinensis_newGene_2675、TEA031525、TEA019489、TEA020024、TEA021543、TEA010470、TEA016435、Camellia_sinensis_newGene_1068、TEA028102、Camellia_sinensis_newGene_28382的蛋白質相互作用主要參與DNA復制，嘌呤代謝，嘧啶代謝、堿基切除修復，核酸切除修復、錯配修復和同源重組。TEA025148、TEA000500、TEA021043、Camellia_sinensis_new Gene_249、TEA008785的互作與植物病原體互作有關。TEA014197、TEA025845、TEA000833、TEA004537的相互作用主要參與植物激素信號轉導。TEA012289參與的互作主要進行亞油酸代謝和亞麻酸代謝。以上結果說明，取食24 h比12 h需啟動更多的蛋白質相互作用來應對假眼小綠葉蟬的侵害，并且需大量的代謝通路來應對外界的侵害。

2.3 差異基因蛋白質相互作用網絡的拓撲屬性

將0 h與12 h、0 h與24 h的差異基因蛋白質相互作用網絡進行綜合得到合并的差異基因蛋白質相互作用網絡，該網絡共531個節點，3 605個互作。對3個網絡進行比較分析，均表現出網絡的小世界特性。網絡的聚合系數、特征路徑長度、最短路徑和半徑表明，它們的全局屬性沒有顯著的差異（表2）。

將0 h與12 h、0 h與24 h的差異基因蛋白質相互作用網絡進行比較分析，發現0～12 h與0～24 h共同的互作有158個，節點80個，不同的互作有3 447個，節點有525個（圖2），說明都勻毛尖茶苗在侵染12 h后繼續啟動更多的蛋白互作來應對假眼小綠葉蟬的侵染。

0≤中介中心性的值≤1，Cb(i) = ∑m≠i≠n[σmn(i)/σmn]，m、n和i都是網絡中節點，即蛋白，σmn表示蛋白m和蛋白n之間的最短路徑數，σmn(i)代表蛋白m到蛋白n之間經過蛋白i的最短路徑數（圖3-a）。接近中心性的值的范圍也在0～1，Cc(i) = 1/avg［S(u,v)］，S(u,v)表示u和v之間的最短路徑，avg［S(u,v)］表示平均最短路徑（圖3-b）。蛋白i的拓撲系數是Ti=avg [S(i,j)]/ni。S(i,j)表示i和j共同的相鄰蛋白數，ni表示i的鄰居數。度是指蛋白的相互作用數目，相互作用數目越多，說明蛋白的度越高，進一步說明這個蛋白越重要。在假眼小綠葉蟬侵染0 h和12 h、0 h和24 h的差異基因蛋白質相互作用網絡中，我們發現蛋白的度服從冪律分布（圖3-d），其中0 h與12 h的差異基因蛋白互作網絡中，P(x)≈40.192x?1.248，R2=0.811，相關性是0.985。0 h與24 h的網絡中，P(x)≈85.166x?0.956，R2=0.681，相關性是0.97。說明大部分蛋白的度比較低，少部分的蛋白的度比較高，是一種無尺度現象，說明預測到的差異基因蛋白質相互作用網絡可靠性高。

表 2 三個網絡的全局特性Table 2 Global properties of 3 networks

圖 2 0 h與12 h的差異基因互作與0 h與24 h的差異基因互作的重疊數與差異數Fig. 2 Number of overlapping and different PPIs between 0-12 h and 0-24 h DEGs

圖 3 假眼小綠葉蟬侵染0 h和24 h的差異基因蛋白互作網絡拓撲屬性Fig. 3 Topological properties of PPINs in 0 h and 24 h DEGs

3 討論與結論

利用同源比對的方法和String數據庫預測出0 h與12 h、0 h與24 h的差異基因的蛋白質相互作用網絡及合并的網絡，并運用Cytoscape 3.3.0將它們可視化，并對3個網絡進行拓撲屬性分析，發現蛋白的度服從冪律分布，說明只有少部分蛋白的相互作用較多，是一種無尺度現象，并且3個網絡都表現出小世界特性。但是，0 h與12 h的差異基因蛋白質相互作用網絡跟0 h與24 h網絡的匹配度低，只有158個重復，造成這種結果的原因可能是預測出的0 h與12 h的差異基因的蛋白質相互作用較少所致。

通過蛋白質相互作用網絡可以預測關鍵蛋白及蛋白質的功能，在合并網絡中，連接度最大的前10個蛋白與0 h與24 h的差異基因蛋白網絡中的關鍵蛋白一致，其中TEA027317、TEA020609、TEA009850的度分別為73、69、67，既在假眼小綠葉蟬侵染0 h和12 h的差異基因互作網絡中，也在0 h和24 h的網絡中，說明在侵染12 h的過程中這三個差異基因啟動相應的互作來抵抗假眼小綠葉蟬的侵害，而在侵染24 h時，除以上三個差異基因的互作，繼續啟動更多的互作來進行防御，與楊會敏[24]研究的假眼小綠葉蟬取食后茶樹葉片內各種酶活性升高啟動更多的酶促反應對害蟲進行防御相一致。本研究在蛋白質相互作用網絡的基礎上研究茶樹抵御假眼小綠葉蟬侵害，為更深入全面了解其抗病機理提供理論依據。

通過對差異蛋白質相互作用網絡中的蛋白進行功能預測，發現在假眼小綠葉蟬取食茶葉過程中，主要通過植物病原體互作，植物激素信號轉導，亞麻酸和亞油酸代謝等代謝通路來抵抗假眼小綠葉蟬的侵染，與前人的研究結果一致[25,26]。同時，茶葉在漫長的進化過程中，演化出通過產生各種次級代謝產物抵御蟲害的自我防衛機制[27]。通過對鳥王種的蛋白質相互作用網絡研究為評價茶葉及其制品的品質及藥用價值，以及用于解讀茶樹抵御假眼小綠葉蟬侵染的代謝機理提供參考。對于選育良種并最終實現茶葉增產意義重大，為進一步開發和利用都勻毛尖茶資源，促進黔南州經濟社會發展提供理論依據。