一株生防煙管菌幾丁質酶表達及抗真菌活性

萬云寶, 陳宇紅, 蔣學飛, 朱芮佳, 魏 濤, 王茂林

(四川大學生命科學學院 教育部生物資源與生態環境重點實驗室， 成都 610065)

1 引 言

植物真菌病害是造成農產品損耗的主要原因之一，在實際生產中造成了不可估量的經濟損失. 病原菌侵染植株后，使農作物局部或整株感病，影響作物生長，嚴重時造成植株死亡，導致農產品產量降低，品質下降. 多數病原菌不僅能在作物生長過程中影響植株狀態，還在農產品的運輸過程中造成產品腐爛變質，是造成果蔬運輸損耗的主要原因[1]. 此外，部分真菌病原菌能夠分泌真菌毒素，食用含有真菌毒素的果蔬能夠導致畸胎或誘發癌癥，威脅人類健康. 如多種鏈格孢產生的鏈格孢毒素[2]以及多種曲霉產生的伏馬霉素B[3-4].

幾丁質，是由N-乙酰基-D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine, GlcNAc)單體通過β-1,4-糖苷鍵連接的聚合物，也是病原真菌細胞壁的主要成分. 在絲狀真菌中，幾丁質和其他葡聚糖含量占細胞壁成分的70%以上[5]，在部分酵母中，幾丁質含量甚至達到細胞干重的10%～20%[6-7]. 幾丁質酶可以通過外切和/或內切水解酶作用將幾丁質裂解為GlcNAc或GlcNAc的可溶性寡聚體. 因此，以幾丁質作為分子靶標，通過幾丁質酶的水解作用來實現植物病害防治是植物病害控制的有效途徑. 而生物防治因子分泌細胞壁裂解酶，裂解病原真菌細胞壁，也成為生物防治微生物拮抗植物病原真菌的主要機制之一[1,8].

煙管菌(Bjerkanderaadusta)屬于非褶菌目，多孔菌科，煙管菌屬. 目前，對于煙管菌(Bjerkanderaadusta)的研究主要集中在環境科學領域[9-10]，但仍不乏煙管菌對植物真菌病害治理的研究報道. 1982年，Dománski[11]發現煙管菌能夠抑制櫟樹(Quercusrobur)褐腐病的發生. 2011年，Bak等[12]研究發現了煙管菌對歐美黑楊(Populuseuramericana)干腐病具有防控能力；2015年，汪華等人[13]篩選出一株對水稻紋枯病菌或瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、茄科羅爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)等引起的植物病害具有很好防治效果的煙管菌M-1；2017年，Zhang等人[14]研究發現煙管菌能夠有效的抑制西瓜蔓枯病菌(Didymellabryoniae)，并在2018年首次探究了煙管菌對核盤菌的抑制作用及其對油菜菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)的防治效果[15]. 但目前，仍然缺乏煙管菌生物防治機制研究. 本研究結合抗病效果和RT-qPCR分析，首次從煙管菌中篩選并克隆出一個幾丁質酶基因，并通過外源表達證明了該酶的抗真菌活性. 推測該基因是煙管菌發揮生防作用過程中的細胞壁裂解酶基因.

2 材料與方法

2.1 材 料

本氏煙(Nicotianabenthamiana).

煙管菌(Bjerkanderaadusta)菌株BK-1從四川省馬爾康市土壤中獲得，保藏于本實驗室，ITS序列號為MW182414(NCBI). 鏈格孢(Alternariaalternata)菌株CD-1，鏈格孢蘋果專化型(Alternariaalternataf. sp.mali)L-1，細極鏈格孢(Alternariatenuissima)SCAU-1和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)DY-1均為本實驗室保藏菌種.尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)(BNCC NO. 143078)，茄鏈格孢(Alternariasolani)(BNCC NO. 337910)購自北納生物(BeNa Culture Collection，BNCC).

PCR引物見表1及表2.

表1 細胞壁裂解酶基因熒光定量PCR引物

表2 幾丁質酶BaCHIB克隆引物

2.2 方 法

2.2.1 煙管菌抗病能力分析 將灰葡萄孢,鏈格孢和細極鏈格孢轉接到PDA培養基中25 ℃活化培養7 d，使用直徑為5 mm的打孔器切取菌絲瓊脂塊作為接種物；煙管菌活化培養7 d后,將5個直徑為5 mm的煙管菌菌絲瓊脂塊接種至液體的100 mL PDB培養基中25 ℃，180 r/min活化培養7 d后使用粉碎機打碎，制成煙管菌菌絲懸液作為抗菌液(AntiL)備用.

離體實驗：從生長30 d的煙草植株上剪取健康的煙草葉片流水沖洗10 min，使用保鮮膜封住葉柄切口處，放置于無菌水浸濕的三層濾紙上，在主葉脈兩側對稱位置分別涂抹50 μL無菌水和煙管菌菌絲懸液后接種病原菌菌絲瓊脂塊作為對照組和實驗組，每組6重復. 再將葉片和濾紙放入上層開口的塑料盒中，上層使用保鮮膜封口保持盒內濕潤. 將其置于溫室內(23 ℃，16 h光照；18 ℃，8 h黑暗)，保持48 h(細極鏈格孢侵染96 h)后對煙草葉片進行拍照記錄.

活體實驗：選取健康的煙草植株，將從上至下第4片葉片作為接種對象，接種方法同離體實驗.將接種后的植株放置在密閉，透光且濕潤的育苗盆內，溫室培養48 h(細極鏈格孢侵染96 h)后拍照記錄.

上述實驗至少重復兩次，并使用ImageJ進行葉片感病面積統計.

2.2.2 生物信息學分析 參考該菌株基因組相關信息(NCBI BioProject ID: PRJNA667319)，使用SignalP v5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對其幾丁質酶基因和β-1,3-糖苷酶基因進行信號肽預測；并在NCBI數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對幾丁質酶的保守結構域進行比對.

2.2.3 對峙培養及RT-qPCR分析 將6種病原真菌和煙管菌接種到PDA培養基中，25 ℃避光條件下活化培養5 d，使用打孔器取各菌落邊緣處直徑為5 mm的菌塊. 分別將煙管菌和一種病原菌接種到新的PDA培養基中，各距離平板邊緣2 cm，并使兩菌塊保持在同一直徑線上. 25 ℃避光培養.

使用真菌RNA快速抽提試劑盒(生工)，提取對峙培養實驗中接種后第6 d相互接觸區域菌絲的RNA，使用EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金)進行反轉錄獲取cDNA.以cDNA為模板，以18S rRNA作為參考基因，使用2× T5 Fast qPCR Mix(SYBRGreenII)試劑盒(擎科)對預測具有信號肽結構的幾丁質酶基因和β-1,3-糖苷酶基因進行表達量測定.

2.2.4 煙管菌幾丁質酶基因BaCHIB克隆 使用高保真酶1-5TM2× Hight-Fidelity Master Mix(MCLAB)擴增去除信號肽區段的幾丁質酶基因BaCHIB-T，并在C端添加6×His蛋白純化標簽. 以煙管菌cDNA為初始模板，后續PCR過程依次使用上一步擴增產物為模板，得到目的片段BaCHIB-T，具體引物如下：①. BaCHIB-Cl-F/R；②. BaCHIB-Cl-F和His1-R；③. BaCHIB-Cl-F和His2-R；④.EcoRⅠ-T-F和NotⅠ-R.

使用限制性內切酶EcoRⅠ和NotI處理載體pPIC9K. 利用同源重組試劑盒(諾唯贊)將BaCHIB-T與線性化的載體同源重組得到重組載體pPIC9K-BaCHIB-T(圖1)，測序正確的表達載體使用限制性內切酶salⅠ線性化，醋酸鋰轉化法[16]轉化畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株.

圖1 重組載體pPIC9K-BaCHIB-T結構

2.2.5 重組蛋白的表達和純化及抗真菌活性 蛋白的表達和純化按照Deng等[17]的方法進行，并進行改進. 重組載體的表達菌株經0.5%的甲醇誘導5 d，相同處理的空載轉化菌株用于對照組. 依次使用含有80，100，120，140 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫與柱結合的目標蛋白. 目的條帶經SDS-PAGE電泳檢測. 幾丁質酶活性測定使用幾丁質酶活性檢測試劑盒(索萊寶).

純化后的重組蛋白，濃度調整為200 μg/mL進行抗真菌活性檢測. 從活化5 d的鏈格孢，茄鏈格孢和灰葡萄孢的平板邊緣切取兩塊邊長約為5～10 mm的正方形菌絲瓊脂塊，并將其置于2 mL離心管中. 每管加入400 μL純化蛋白溶液作為實驗組，等量蛋白洗脫液作為對照組. 25 ℃暗培養48 h后，觀察菌絲生長狀況.

3 結果與分析

3.1 煙管菌的抗病能力分析

以煙草為寄主，檢驗煙管菌對由灰葡萄孢引起的灰霉病，由鏈格孢引起的赤星病和黑斑病的抑制效果進行抗病表型實驗(表3). 結果表明，在離體和活體條件下，煙管菌能夠使灰霉病病斑面積分別減少91.97%和100%；使赤星病病斑面積減少77.12%和75.03%. 而在黑斑病的實驗組中，離體條件下并未觀察到明顯的抗病效果；活體接種病原菌時，多次重復未檢測到明顯發病跡象.

表3 煙管菌對煙草真菌病害的抗病能力

煙草灰霉病、煙草赤星病和煙草黑斑病分別由灰葡萄孢、鏈格孢和細極鏈格孢引起.煙草葉片的病斑面積測量后，被用以比較煙管菌對上述三種病害的抗病能力.數據使用單因素方差分析，“*”表示差異顯著(P< 0.001).

3.2 生物信息學分析

對該菌株的基因組進行分析，發現煙管菌該菌株具有11個幾丁質酶基因，12個β-1,3-糖苷酶基因. 其中5個幾丁質酶基因(EVM0010419;EVM0005032;EVM0003995;EVM0003825;EVM0009013)和3個β-1,3-糖苷酶基因(EVM0006890;EVM0003791;EVM00010135)所對應的蛋白序列N端具有信號肽結構. 煙管菌幾丁質酶基因的保守結構域分析表明，煙管菌幾丁質酶基因均屬于GH 18基因家族. 此外，EVM0005032和EVM0003825末端帶有Chic_BD(aromatic chitin/cellulose binding site residues)結構，屬于B類幾丁質酶(CHIB).

3.3 幾丁質酶基因和β-1,3-糖苷酶基因的表達譜分析

RT-qPCR分析對峙培養第6 d的煙管菌細胞壁裂解酶基因的表達水平. 結果表明在該階段，多個基因表達量上調，如幾丁質酶基因EVM0005032，EVM0003825和EVM0009013，β-1,3-糖苷酶基因EVM0006890(圖2). 尤其是幾丁質酶基因EVM60005032(BaCHIB)，在與鏈格孢、茄鏈格孢、灰葡萄孢和尖孢鐮刀菌的對峙培養時，該基因分別上調表達27.3倍、31.7倍、50.3倍和41.3倍(圖2B)，但在與鏈格孢蘋果專化型和細極鏈格孢相互作用時，該基因未發生相應的上調表達. 總體上來看，除基因EVM0005032外，其它基因上調的情況主要集中在煙管菌與茄鏈格孢和尖孢鐮刀菌的對峙培養中. 如基因EVM0009013和EVM0006890在應對茄鏈格孢時表達上調(圖2e,2f). 另外，同屬B類幾丁質酶基因的EVM0003825僅在與尖孢鐮刀菌的對峙培養中出現明顯的上調表達(圖2d).

圖2 接種6d后煙管菌預測具有信號肽結構的細胞壁裂解酶基因相對表達量分析

3.4 幾丁質酶BaCHIB的抗真菌活性

使用鎳柱對重組蛋白BaCHIB進行了分離純化，在咪唑濃度為80 mmol/L時目的蛋白能被高效洗脫，并在后續的SDS-PAGE中顯示為單一條帶(圖3). 大小在50～70 kD之間，與預測分子大小63.6 kD相近. 對純化后的重組蛋白進行活性測定，在37 ℃下幾丁質酶活性約為17.7 U/mg.

圖3 重組蛋白BaCHIB的純化

對幾丁質酶BaCHIB進行抗真菌活性測試，經48 h溫育，相較于對照組，添加BaCHIB的實驗組中，鏈格孢、茄鏈格孢和灰葡萄孢均無新生菌絲生長的痕跡，表現出明顯的生長抑制作用.

將煙管菌單獨培養作為對照組；A1為鏈格孢;A2為鏈格孢蘋果專化型;A3為茄鏈格孢;A4為細極鏈格孢;B灰葡萄孢;F為尖孢鐮刀菌.根據多重比較結果，不同字母表示差異顯著(P≤ 0.05).

Fig.2 Relative expression levels of cell-wall lyase genes with a signal peptide at 6 days after inoculation (DAI)

CK isBjerkanderaadustaonly;A1 isAlternariaalternata;A2 isAlternariaalternataf. sp.mali;A3 isAlternariasolani;A4 isAlternariatenuissima;BisBotrytiscinerea;FisFusariumoxysporum. Different letters show significant differences based on Duncan’s Multiple Range Test (P≤ 0.05).

4 討 論

本研究通過離體和活體實驗，證明了煙管菌對煙草灰霉病和赤星病具有良好的抗病效果. 但在煙草黑斑病的離體侵染4 d后，煙管菌施用與否對發病面積并無明顯影響，說明在離體條件下煙管菌對煙草黑斑病沒有抗病效果，而在活體實驗中，實驗組和對照組均無病斑的發生，該現象可能由于使用的細極鏈格孢菌株侵染能力較弱，導致侵染后無感病表型出現.

生防微生物通過分泌細胞壁裂解酶抑制病原菌的生長是其發揮生防作用的主要機制之一，如幾丁質酶，β-1,3-糖苷酶，脂肪酶和蛋白酶，這些酶體通常在破壞病原體的細胞壁中起著至關重要的作用. 為了初步探究煙管菌細胞壁裂解酶在煙管菌抗病中的作用，本研究通過生物信息學和RT-qPCR的角度出發，對煙管菌部分細胞壁裂解酶進行分析.

GH 18家族廣泛存在于原核生物，真核生物乃至病毒中. 按照結構域差異可分為兩大類[18]：Class III(B類)和Class V(A類). 其中B類幾丁質酶含有幾丁質或多糖結合位點，這類幾丁質酶主要參與真菌生長發育過程中的營養吸收，并在線蟲和部分真菌寄生昆蟲的過程中發揮重要作用[18-21]. 此外，該類幾丁質酶基因結構與植物幾丁質酶基因相似，而后者通常與寄主植物對病原細菌，真菌及線蟲的抗性相關[22-24]. 由此可推測，煙管菌幾丁質酶基因EVM0005032(BaCHIB)和EVM0003825可能在煙管菌對病原真菌的生物防治中發揮重要的生物學作用.

圖4 重組幾丁質酶BaCHIB的抗真菌活性

使用RT-qPCR對預測具有信號肽結構的幾丁質酶基因和β-1,3-糖苷酶基因的表達譜進行分析測定，借此篩選出可能具有抗真菌活性的細胞壁裂解酶基因. 在對峙培養過程中，多個基因在接種6 d后表達量上調，特別是，幾丁質酶基因EVM0005032. 結果表明部分植物真菌性病原，如鏈格孢，茄鏈格孢，尖孢鐮刀菌和灰葡萄孢，能夠直接誘導煙管菌細胞壁裂解酶基因的表達. 這一結果與Banani等[25]的研究相似，桃梅奇酵母(Metschnikowiafructicola)菌株AP47在桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)細胞壁提取物誘導下，其幾丁質酶基因MfChi上調表達14倍，并在后續的實驗中表現出對桃子褐腐病的顯著抑制能力. 此外，Essghaier等[26]在研究一種嗜鹽菌對草莓灰霉病的防治過程中，發現枯草芽孢桿菌能夠分泌多種具有抗真菌活性的酶類：幾丁質酶，β-1,3-糖苷酶，纖維素酶和蛋白酶；Urbina等[27]在其研究中也發現橄欖假絲酵母分泌的一種β-1,3-糖苷酶對蘋果病原菌擴展青霉具有拮抗能力. 上述研究為煙管菌幾丁質酶BaCHIB具有抗真菌活性的假設提供了相應的依據. 另一方面，同屬于B類幾丁質酶的基因EVM0003825，僅在煙管菌與尖孢鐮刀菌的對峙培養中出現上調表達，而未出現類似于BaCHIB在應對多種病原真菌時的高表達現象，這一結果說明，幾丁質酶基因BaCHIB可能在應對病原真菌具有一定的特異性.

結合抗病效果與幾丁質酶基因BaCHIB的誘導表達分析，表明煙管菌對植物真菌病害抗病表現與BaCHIB的誘導表達情況的出現高度同步. 如煙管菌對煙草灰霉病和赤星病具有抗病能力，幾丁質酶基因BaCHIB在與灰葡萄孢和鏈格孢的對峙培養中出現誘導表達；對煙草黑斑病沒有顯著的抗病效果，BaCHIB不出現顯著的誘導表達. 這一結果為幾丁質酶基因BaCHIB在煙管菌的生物防治中發揮重要作用提供了又一關鍵證據.

通過真核外源表達系統，煙管菌幾丁質酶BaCHIB能夠被成功表達和純化. 并表現出幾丁質酶活性和良好的抗真菌活性. 這一結果驗證了幾丁質酶BaCHIB具有抗真菌能力. 在Ahmed等[28]的研究中，綠色木霉幾丁質酶在濃度為2.23 mg/mL時，對尖孢鐮刀菌培養5 d后的抑菌能力為45%；而另一種來自珊瑚球菌的幾丁質酶，在濃度為0.15 mg/mL和0.75 mg/mL時，對稻瘟病菌分生孢子萌發抑制率分別在40%和10%左右[29]；而來源于哈茨木霉的幾丁質酶Chit46，在濃度為3.9 μg/mL時，對灰葡萄孢培養5 d后的生長抑制能力為76%，表現出較上述兩種幾丁質酶更為高效的抑菌能力[17].在本研究中，三種病原真菌在0.2 mg/mL的幾丁質酶溶液中培養2 d后，新生菌絲生長被強烈抑制，證明煙管菌幾丁質酶BaCHIB同樣具有較好的抗真菌能力.

本實驗結果表明，具有生防能力的煙管菌BK-1可能是通過分泌幾丁質酶BaCHIB實現其對一些植物真菌病害的抑制，但具體的生物防治機制，仍然需要在此基礎上進行更加深入的研究.