日本落葉松凋落針葉總黃酮的提取工藝及抗氧化活性研究

駱 娟， 侯 靜， 楊舒婷， 張傲來， 馬曉娜， 白 潔， 何廷美， 譚迎春， 劉明沖， 葉 平， 朱大海

(1.四川大學生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室， 成都 610065；2.四川臥龍國家級自然保護區管理局， 汶川 623000；3.龍溪-虹口國家級自然保護區， 都江堰 611830)

1 引 言

日本落葉松(Larixkaempferi)系松科落葉松屬高大喬木，原產于日本，于19世紀末作為人工造林樹種引進至我國，由于生長迅速、適應性強的優點，在遼寧、四川等14個省市廣為種植[1].隨著日本落葉松快速生長，在發揮經濟和生態價值的同時，也帶來系列嚴重問題.由于日本落葉松生長迅速而造成其伴生樹種大多枯死；隨著大面積日本落葉松純林的形成，其林下植物多樣性降低，大量積累的凋落針葉層存在著火險、病蟲害等嚴重隱患[2].適當撫育間伐，對增加日本落葉松人工林群落層次結構，提高林下生物多樣性具有促進作用[3].因此有必要對大量廢棄的日本落葉松枝葉展開綜合化利用的研究.

松科植物的針葉中含有多種活性物質，如黃酮、揮發油、多糖、多酚等，具有抗氧化、降血脂、延緩衰老、抑菌及抗癌的功效[4-8].近年來，許多學者圍繞松科植物針葉的總黃酮提取和生物學活性進行了研究.Shi等[9]通過乙醇回流法從雪松的松針中提取總黃酮并發現其可以調節細胞周期和細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的增殖.王冉等[10]利用超聲波輔助乙醇提取紅松松針中的總黃酮，結合響應面法優化了紅松總黃酮提取工藝.司傳領等人[11]從日本落葉松新鮮松針95%乙醇提取物中檢測到兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素等7種化合物，并對提取物進行了分級萃取，結果表明乙酸乙酯溶性部分抗氧化活性較強.目前對日本落葉松凋落針葉的研究未見報道.本研究在現有研究的基礎上，超聲提取結合響應面法優化了日本落葉松凋落針葉的總黃酮提取工藝，并檢測提取產物的抗氧化活性，為進一步綜合利用日本落葉松這一植物資源提供科學依據.

2 材料與方法

2.1 材 料

40林齡日本落葉松人工林的林下凋落針葉，采自四川臥龍自然保護區.對照品為蘆丁.

乙醇，正丁醇，石油醚，乙酸乙酯，維生素C等所有試劑均為分析純.

旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA)；電子精密分析天平(瑞士Mettler公司，MS半微量)；純水儀(成都威思達智能公司，RM-220)；電熱套(北京中興偉業儀器有限公司，ZDHW)；多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司，SpectraMax M2)等.

2.2 實驗方法

2.2.1 總黃酮含量測定 以蘆丁為對照，制作標準曲線.以吸光度為縱坐標，蘆丁溶液濃度為橫坐標，得到回歸方程：y=0.9178x+0.0722(R2=0.999 3).日本落葉松凋落針葉提取物總黃酮含量用比色法測定.將20 μL濃度為1 mg/mL的樣品與30 μL 5% NaNO2混合.6 min后，加入10%AlCl3溶液50 μL.5 min后，再加入10%NaOH溶液100 μL，振蕩混勻，在25 ℃下孵育15 min.用酶標儀在510 nm處測量吸光度.根據回歸方程計算提取液中總黃酮含量.用蘆丁當量(RE)表示每克干物質(dw)中的總黃酮含量，即mgRE/gdw.每個樣品做3次平行實驗.

2.2.2 單因素實驗 0.1 g日本落葉松凋落針葉粉末為樣品，以總黃酮提取量為考察指標，分別以6個因素：乙醇濃度(40%、50%、60%、70%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1 mL/g)、提取溫度(45、60、75、80、85 ℃)、提取時間(30、40、50、60 min)、超聲功率(210、240、270、300 W)、超聲頻率(20、25、40、59 kHz)進行單因素試驗，得到各因素對凋落葉總黃酮提取量影響的實驗結果.

2.2.3 響應面優化設計 基于單因素實驗，選取乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時間(C)3個因素為自變量，總黃酮量(Y)作為響應值，用Design-Expert8.0軟件進行實驗設計.試驗各因素及水平見表1.

表1 響應面實驗設計中的各因素及水平

2.2.4 日本落葉松凋落針葉總黃酮提取物不同萃取相制備 稱取10 g日本落葉松凋落針葉粉末于500 mL錐形瓶中，在優化的提取條件下超聲提取2次，合并提取液，旋蒸成浸膏，加入蒸餾水200 mL重懸，重懸液依次用石油醚(沸程30～60 ℃)、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，萃取液經減壓濃縮，氮吹儀干燥后，獲得日本落葉松凋落針葉的四個萃取相：石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水余相.

2.2.5 日本落葉松凋落針葉總黃酮不同萃取相抗氧化活性比較

(1) DPPH清除能力測定[12].DPPH配成1 mmol/L的乙醇溶液，使用前用無水乙醇稀釋至0.1 mmol/L的工作濃度，不同萃取相和Vc用50%乙醇溶液配成不同濃度.96孔板加入100 μL不同濃度樣品、Vc(10～100 μg/mL)和50%乙醇，分別作為實驗組、陽性對照和空白組，加100 μLDPPH工作液，混勻室溫放置30min，酶標儀測定517 nm處吸收值.DPPH自由基清除率(%)=(1-As/Ac)100.式中，As表示樣品或陽性對照Vc的吸收值；Ac為空白組吸收值.

(2) ABTS清除能力測定[13].磷酸鹽緩沖液PBS備用(pH 7.4，0.2 mmol/L)，以PBS為溶劑配制終濃度為7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，暗藏12～16 h生成ABTS自由基.實驗前用PBS將ABTS自由基溶液稀釋到A734為0.7±0.02，作為ABTS工作液.實驗時在96孔板中加入100 μL不同濃度的樣品和陽性對照Vc(10～100 μg/mL)和50%乙醇溶液，加入100 μL ABTS工作液，混勻，室溫放置30 min，測定734 nm處吸收值.ABTS自由基清除率(%)=(1-As/Ac)100.式中，As表示樣品或陽性對照Vc的吸收值；Ac為空白組吸收值.

(3) 總還原力測定[14].配制磷酸鹽緩沖液PBS備用(pH 6.6，0.2 mmol/L)，在96孔板中加入25 μL不同濃度樣品和陽性對照Vc(10～100 μg/mL)及50%乙醇分別作為實驗組、陽性對照和空白組.加入50 μL PBS和25 μL 1%的鐵氰化鉀水溶液，混勻后于45 ℃條件下孵育1 h，再加入50 μL 10%的三氯乙酸水溶液和60 μL 0.1%的FeCl3水溶液，混勻后測定700 nm處吸收值.A700越大表明樣品的總還原力越強.

上述實驗重復3次.

2.2.6 數據分析 GraphPad Prism用于統計分析和IC50的計算，組建方差分析采用ANOVA單因素方差分析，并輔以Dunnett’st多重檢驗，P<0.05被認為具有顯著性差異.

3 結果與分析

3.1 單因素實驗結果

各因素對日本落葉松凋落針葉總黃酮提取率的影響見圖1.乙醇濃度、液料比、提取時間對總黃酮的提取率均呈現先升后降的趨勢.經差異顯著性分析，三者對總黃酮提取率影響較大，因此選擇這三個因素進行響應面優化設計.隨著溫度的提高，總黃酮提取率不斷增加(圖1c).考慮到操作的可行性、安全性和成本等，將提取溫度固定為80 ℃，超聲功率選擇270 W(圖1e)，超聲頻率定為40 kHz(圖1f).

3.2 總黃酮提取工藝的響應面優化設計

采用Box-Behnken實驗設計方法[15]，以乙醇濃度(A)、液料比(B)和提取時間(C)為待優化因素，進行三因素三水平的響應面優化設計，見表2.

表2 響應面優化設計和實驗結果

以總黃酮含量為響應值進行多元回歸擬合分析，得到擬合二次回歸方程：Y=136.2-3.25A+4.93B+2.11C+1.72AB+1.37AC+0.53BC-28.34A2-10.69B2-1.22C2.本模型的F值為16.8，P<0.01，具有顯著性；失擬項的P值為0.083，不顯著，說明所建模型適宜.回歸方程相關系數R2=0.9558，線性關系良好.實驗中的變異系數2.07%，實驗操作可靠，模擬方差能夠很好的模擬真實的實驗值.B、A2、B2三項的P<0.05，具有顯著性，說明液料比、乙醇濃度的平方和液料比的平方對實驗結果也有顯著影響.

(a) Ethanol concentration, (b) solvent to material ratio, (c) extraction temperature, (d) extraction time, (e) ultrasonic power, (f) ultrasonic frequency

表3 以總黃酮含量為響應值的響應面回歸方程方差分析

圖2是根據回歸方程，以總黃酮含量為響應值繪出的乙醇濃度、液料比和提取時間相互影響的響應面曲線.經Design-Expert8.0軟件分析，得到超聲輔助提取法提取日本落葉松凋落針葉總黃酮成分的最佳條件是：乙醇濃度59.12%、液料比32.71∶1 mL/g、提取時間58.25 min，提取溫度80 ℃、超聲功率270 W、超聲頻率40 kHz，在此條件下，總黃酮含量模擬為112.911 mgRE/gdw.出于可操作性的考慮，驗證時乙醇濃度選擇60%，液料比33∶1 mL/g，提取時間58 min，其他條件與響應面實驗條件保持一致.實驗驗證的總黃酮含量達到117.353±5.016 mgRE/gdw，兩者沒有顯著性差異(P>0.05)，符合響應面優化的預測值.

圖2 超聲輔助浸提法提取日本落葉松凋落針葉總黃酮的響應曲面線

3.3 不同萃取相的總黃酮含量比較

采用優化后的工藝提取日本落葉松凋落針葉的總黃酮，經分級萃取后得到的各萃取相總黃酮含量見圖3.正丁醇相的總黃酮含量顯著高于其他萃取相，為736.401 3±38.585 2 mgRE/gdw.

3.4 不同萃取相的抗氧化活性比較

不同萃取相對DPPH自由基的清除能力隨著濃度增加逐漸增強，即抗氧化能力隨濃度增大而增強(圖4a).抗氧化活性從大到小依次是正丁醇相>水余相>乙酸乙酯相>石油醚相，但都弱于Vc，其IC50值分別為7.438 μg/mL、14.09 μg/mL、29.79 μg/mL、103.6 μg/mL，對照品VC的IC50值為7.259 μg/mL.

圖3 日本落葉松凋落針葉不同萃取相的總黃酮含量

不同萃取相對ABTS自由基的清除能力隨著濃度增加呈現上升趨勢(圖4b)，各萃取相抗氧化活性從大到小依次是正丁醇相>水余相>乙酸乙酯相>石油醚相，其IC50值分別為6.425 μg/ml、9.169 μg/mL、10.77 μg/mL、805 μg/mL.對照品VC的IC50值為8.455 μg/mL，日本落葉松凋落針葉的正丁醇萃取相表現出了比VC更高的清除能力.

各萃取相的總還原力均低于對照品VC，且還原力強弱與DPPH和ABTS清除實驗結果保持一致，正丁醇相的總還原力最強，其余按照總還原從大到小依次是水余相、乙酸乙酯相，石油醚相(圖4c).該結論與不同萃取相的總黃酮含量比較結果相互佐證，表明總黃酮含量與體外抗氧化活性呈正相關的關系.

4 討 論

黃酮類化合物廣泛存在于自然界中，因其存在多種藥理活性，被認為是一類重要的天然產物.本文采用超聲輔助浸提法對日本落葉松凋落針葉總黃酮提取工藝進行研究和優化.單因素實驗中，總黃酮提取率隨提取溫度的升高不斷升高，可能與提取物中的成分有關.現有研究表明，松針黃酮主要是由一些黃酮、黃酮苷及多聚體酚化合物前花青素組成[16].劉東彥等[17]從雪松松針中分離到大量以楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素及它們的苷類為主的黃酮類化合物.徐麗珊等人[18]優化了濕地松松針的總黃酮提取工藝，確定的最佳提取溫度是100 ℃；皮婷婷等人[19]報道了馬尾松的最佳提取溫度是73 ℃；向福等人[20]得到大別山松針黃酮最佳提取溫度是80 ℃，說明松針黃酮存在提取溫度高的現象.結合不同萃取相的總黃酮含量測定結果分析，日本落葉松凋落針葉中的黃酮類物質具有極性大、沸點高，穩定性強的特點.

經過優化，在60%乙醇溶液、33∶1 mL/g的液料比、提取溫度80 ℃、超聲功率270 W、超聲頻率40 kHz條件下提取58 min，日本落葉松凋落針葉的總黃酮可以達到117.353±5.016 mgRE/gdw的提取量.分級萃取后，正丁醇相的總黃酮含量最高，可達到736.4013±38.5852 mgRE/gdw.總黃酮的不同萃取相中，抗氧化活性從大到小依次為正丁醇相>水余相>乙酸乙酯相>石油醚相，正丁醇相的DPPH自由基清除能力與抗壞血酸接近，ABTS自由基清除能力則優于抗壞血酸，約是其1.3倍.本研究結果為日本落葉松凋落針葉總黃酮物質的研究開發提供了理論依據.

有研究發現，落葉松(Larixgmelinii)新鮮針葉總黃酮含量高于凋落針葉中的總黃酮含量，且對DPPH自由基的清除能力略高于凋落針葉[21].由于臥龍自然保護區的日本落葉松屬于大熊貓棲息地關鍵地段的人工林，不允許采伐，而且大面積栽植的日本落葉松每年產生的凋落葉既影響林下植物多樣性，也帶來了火災和病蟲害隱患，因此本研究側重于日本落葉松廢棄物資源再利用的研究.研究結果表明日本落葉松凋落針葉可以作為一種潛在的抗氧化劑資源.今后將繼續開展提取物成分的分析，以確定其可能的藥理活性.