新型二氫葉酸還原酶抑制劑iclaprim對金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性

郝凌云， 何春燕， 楊 涵， 陳雯靜， 崔澤林， 湯 榮， 舒 文， 劉慶中

金黃色葡萄球菌（金葡菌）是臨床上引起皮膚軟組織感染、心內膜炎、骨髓炎和血流感染等疾病的常見病原菌。由于抗菌藥物的廣泛使用導致金葡菌耐藥性不斷增強，給全球公共衛生安全帶來較大威脅[1]。

二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase,DHFR）是細菌葉酸合成和DNA復制過程的重要生物合成酶[2]。其新型選擇性抑制劑iclaprim是基于甲氧芐啶的結構數據優化設計合成，與DHFR更具親和力，具有更強的體內外抗金葡菌（包括MRSA）活性，并能抑制金葡菌毒素表達[3-4]。研究顯示，iclaprim在血漿中具有快速殺菌作用[5]，該藥針對金葡菌皮膚軟組織感染及院內肺炎治療目前已進入Ⅲ期臨床試驗[2]。

為了解iclaprim對本地區細菌的體外抗菌活性，本研究收集了上海交通大學附屬第一人民醫院臨床分離的金葡菌498株，檢測其對iclaprim的敏感性，并與甲氧芐啶、磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑比較。同時，探討iclaprim與磺胺類藥物聯合使用對金葡菌的體外協同作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2016年1月—2018年12月我院分離自各種臨床標本的非重復金葡菌498株。所有菌株均經VITEK 2-Compact微生物鑒定系統鑒定。金葡菌ATCC 25923 （紙片法）和ATCC 29213（肉湯微量稀釋法）為藥敏試驗質控菌株。

1.1.2 儀器和試劑 VITEK 2-Compact微生物鑒定系統及配套鑒定卡片為法國生物梅里埃公司產品；iclaprim粉劑為美國MedChemExpress（MCE）公司產品；甲氧芐啶和磺胺甲唑粉劑購于美國Sigma-Aldrich公司；頭孢西丁紙片（30 μg /片）為英國OXOID公司產品；陽離子調節Mueller–Hinton（MH）肉湯購于美國BD公司；96孔無菌細胞培養板由美國Corning公司提供。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 參照CLSI 2019年推薦的肉湯微量稀釋法[6]檢測iclaprim、甲氧芐啶、磺胺甲唑、iclaprim-磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑對菌株的最低抑菌濃度（MIC）。各種藥物檢測濃度范圍：iclaprim為0.015～16 mg/L，甲氧芐啶為0.015～64 mg/L，磺胺甲唑為16～1 024 mg/L，甲氧芐啶-磺胺甲唑（1∶19）為（0.015-0.285）～（16-304） mg/L，iclaprim-磺胺甲唑（仿照甲氧芐啶-磺胺甲唑配方，1∶19）為（0.015-0.285）～（8-152） mg/L。

1.2.2 結果判定 以甲氧芐啶MIC≤8 mg/L為敏感，≥16 mg/L為耐藥；磺胺甲唑MIC≤256 mg/L為敏感，≥512 mg/L為耐藥；甲氧芐啶-磺胺甲唑MIC≤2-38 mg/L為敏感，≥4-76 mg/L為耐藥[6]。iclaprim目前并無發布的臨床折點，根據MRSA的MIC值分布、藥動學/藥效學及Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗結果，文獻[7]建議iclaprim對金葡菌的MIC≤1 mg/L為敏感。iclaprim-磺胺甲唑聯合藥敏試驗用分級抑菌濃度指數（FIC） （FIC=評估。FIC≤0.5為協同作用，0.5＜FIC≤1為相加作用，1＜FIC≤2為無關作用，FIC＞2為拮抗作用[8]。

1.2.3 甲氧西林敏感性檢測 根據文獻[6]，頭孢西丁紙片法檢測金葡菌對甲氧西林的敏感性，抑菌圈直徑≤21 mm為耐藥（即MRSA），≥22 mm為敏感（即MSSA）。

1.2.4 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件對實驗結果進行卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲氧西林耐藥性

498株金葡菌中，268株（53.8%）對甲氧西林耐藥，為MRSA；230株（46.2%）敏感，為MSSA。

2.2 iclaprim和iclaprim-磺胺甲唑的MIC分布

498株金葡菌中，iclaprim的MIC范圍為0.015～＞16 mg/L， MIC50、MIC90為0.25、0.5 mg/L。根 據MIC50、MIC90值，MRSA（0.25、0.5 mg/L）和MSSA（0.12、0.25 mg/L）間僅有1個稀釋梯度的差別，因此iclaprim對兩者具有相似的抗菌能力。所有菌株中，有35株（7.0%）對iclaprim敏感性降低（MIC＞1 mg/L），且不敏感率在MRSA和MSSA菌株間差異無統計學意義（8.6%對5.2%，χ2=2.145，P=0.143）。iclaprim 對金葡菌的MIC值分布見表1。

表1 Iclaprim、甲氧芐啶、磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑對金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性Table 1 In vitro activities of iclaprim, trimethoprim, sulfamethoxazole, and trimethoprim-sulfamethoxazole against S. aureus isolates

表1 Iclaprim、甲氧芐啶、磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑對金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性Table 1 In vitro activities of iclaprim, trimethoprim, sulfamethoxazole, and trimethoprim-sulfamethoxazole against S. aureus isolates

a Intermediate or resistant (nonsusceptible).MRSA, methicillin-resistant S. aureus; Trimethoprim-sulfamethoxazole combination =1:19; MSSA, methicillin-sensitive S. aureus.

Bacteria /Antimicrobial agent MIC range/(mg/L) MIC50 /(mg/L) MIC90/(mg/L) Ra/% S/%MRSA (n=268)Iclaprim 0.06-＞16 0.25 0.5 8.6 91.4 Trimethoprim 0.5-＞64 2 16 10.0 90.0 Sulfamethoxazole 32-1024 128 256 9.0 91.0 Trimethoprim-sulfamethoxazole ＜0.015/0.285-＞16/304 0.06 0.5 5.6 94.4 MSSA (n=230)Iclaprim 0.015-＞16 0.12 0.25 5.2 94.8 Trimethoprim 1-＞64 2 4 8.7 91.3 Sulfamethoxazole 16-1024 128 128 2.2 97.8 Trimethoprim-sulfamethoxazole ＜0.015/0.285-＞16/304 0.06 0.12 5.2 94.8 S. aureus (n=498)Iclaprim 0.015-＞16 0.25 0.5 7.0 93.0 Trimethoprim 0.5-＞64 2 8 9.6 90.4 Sulfamethoxazole 16-1024 128 256 5.8 94.2 Trimethoprim-sulfamethoxazole ＜0.015/0.285-＞16/304 0.06 0.25 5.4 94.6

2.3 iclaprim對甲氧芐啶、磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥菌株的抗菌活性

表1顯示，有48株（9.6%）、29株（5.8%）和27株（5.4%）的金葡菌分別對甲氧芐啶、磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥。金葡菌對iclaprim的不敏感率較低（7.0%），與上述三種藥的耐藥率差異無統計學意義（P值分別為0.136、0.438和0.294，P＞0.05）48株甲氧芐啶耐藥菌的iclaprim MIC范圍為0.12～＞16 mg/L，比全部金葡菌的范圍窄4個稀釋梯度，其中43.8%（21/48）對iclaprim不敏感；29株磺胺甲唑耐藥菌的iclaprim MIC范圍為0.06～＞16 mg/L，44.8%（13/29）對iclaprim不敏感；27株甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥菌的iclaprim MIC范圍為2～＞16 mg/L（全不敏感），更是比甲氧芐啶耐藥金葡菌又下降了4個稀釋梯度。需要指出的是，無論甲氧芐啶、磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥與否，都有iclaprim MIC較高的菌株（≥16 mg/L）。對于三種藥物耐藥的MRSA，iclaprim的抗菌活性也顯著低于其敏感的MRSA菌株（根據MIC90值相差≥32倍）。不過無論甲氧西林耐藥與否，三種藥物耐藥的菌株都具有很高的iclaprim MIC90值（≥16 mg/L）。

3 討論

DHFR參與細菌葉酸和胸苷合成，是抗菌藥物開發的重要靶點[9-10]。甲氧芐啶作為FDA唯一批準的DHFR抑制劑使用已近40年[10]，出現了與其親和力降低的DHFR突變型（如金葡菌DHFR的F98Y突變）[11-13]，導致抗菌活性下降[14]。由于抗菌活性相對較差，且易于產生耐藥性，臨床上甲氧芐啶常與增效劑磺胺甲唑聯合使用（即甲氧芐啶-磺胺甲唑）[9]。不過，甲氧芐啶-磺胺甲唑能引起磺胺相關的嚴重不良反應，如過敏反應、惡液質、肝毒性等[15]。而iclaprim是一種單藥成分，沒有上述安全缺陷，效力比甲氧芐啶提高了近20倍[16]，與甲氧芐啶-磺胺甲唑具有相似的抗菌能力[2,16]。因此，iclaprim有可能成為金葡菌感染的替代治療藥物。

表2 Iclaprim聯合磺胺甲唑對金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性Table 2 In vitro antimicrobial activity of iclaprim in combination with sulfamethoxazole against S. aureus isolates

表2 Iclaprim聯合磺胺甲唑對金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性Table 2 In vitro antimicrobial activity of iclaprim in combination with sulfamethoxazole against S. aureus isolates

Iclaprim-sulfamethoxazole combination= 1:19. MRSA, methicillin-resistant S. aureus; MSSA, methicillin-sensitive S. aureus.

Bacteria/ Antimicrobial agent Fractional inhibitory concentration /n (%)≤ 0.5(Synergy） 0.5 to ≤ 1(Additive) 1 to ≤ 2(Indifference) ＞2(Antagonism)MRSA (n=268)Iclaprim 266 (99.3) 2 (0.7) 0 0 Sulfamethoxazole MSSA (n=230)Iclaprim 230 (100) 0 0 0 Sulfamethoxazole S. aureus (n=498)Iclaprim 496 (99.6) 2 (0.4) 0 0 Sulfamethoxazole Bacteria/ Antimicrobial agent Single antibiotic/(mg/L) Iclaprim-sulfamethoxazole combination/(mg/L)a MIC range MIC50 MIC90 MIC range MIC50 MIC90 Synergism MRSA (n=268)Iclaprim 0.06->16 0.25 0.5 0.015-8 0.015 0.03 8-16 Sulfamethoxazole 32-1024 128 256 0.285-152 0.285 0.57 449 MSSA (n=230)Iclaprim 0.015->16 0.12 0.25 0.015-8 0.015 0.03 8 Sulfamethoxazole 16-1024 128 128 0.285-152 0.285 0.57 224-449 S. aureus (n=498)Iclaprim 0.015->16 0.25 0.5 0.015-8 0.015 0.03 16 Sulfamethoxazole 16-1024 128 256 0.285-152 0.285 0.57 449

目前，國際上已有iclaprim體外抗菌活性的報道[7,17-21]，不過我國仍然缺乏相關數據。北美和歐洲的數據顯示，iclaprim對金葡菌具有高度活性（MIC50、MIC90為0.03～0.06、0.12 mg/L），南 美和亞太地區的金葡菌也具有較低的MIC50、MIC90（0.06、0.12 mg/L）[7,17-18]。本結果顯示，絕大多數臨床金葡菌（93.0%）對iclaprim敏感，但MIC50、MIC90值（0.25、0.5 mg/L）要高于上述國外報道，表明iclaprim對本研究菌株的活性弱于國外菌株4～8倍。出現這種情況可能與我國流行的菌株克隆與國際上其他地區不同有關。另外，本研究還顯示iclaprim對金葡菌的活性基本不受甲氧西林的耐藥性影響，MRSA和MSSA菌株的MIC50、MIC90值僅相差1個稀釋梯度。

iclaprim對F98Y DHFR能維持足夠的親和力[4]。但是，本研究并未觀察到iclaprim與甲氧芐啶在耐藥率上存在顯著差異，而且43.7%甲氧芐啶耐藥菌株對iclaprim不敏感。這一結果提示，DHFR可能存在新的突變或存在其他導致iclaprim抗菌活性降低的機制。

在本課題研究中，iclaprim對MSSA（MIC50、MIC90：0.12、0.25 mg/L）的活性是甲氧芐啶（MIC50、MIC90：2、4 mg/L）的16倍，iclaprim對MRSA（MIC50、MIC90：0.25、0.5 mg/L）的活性是甲氧芐啶（MIC50、MIC90：2、16 mg/L）的8～32倍；對MSSA，與甲氧芐啶-磺胺甲唑（MIC50、MIC90：0.06、0.12 mg/L）相比，iclaprim的活性稍弱，而對MRSA則與甲氧芐啶-磺胺甲唑相當（MIC90：0.5 mg/L）（ 表1）。但就金葡菌總體而言，iclaprim（MIC50、MIC90：0.25、0.5 mg/L）的活性是甲氧芐啶（MIC50、MIC90：2、8 mg/L）的8～16倍，這一數據也與國外的報道（8～32倍）基本一致[7]。

Huang等[22]報道，iclaprim對甲氧芐啶和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥金葡菌國際菌株（歐美、亞太、拉丁美洲、非洲、中東等地區）的MIC90分別為＞16 mg/L和＞8 mg/L。而iclaprim對上述同類藥物耐藥菌株同樣具有較低的體外活性，MIC50、MIC90值分別達1、16 mg/L和＞16、＞16 mg/L。由此可見，對甲氧芐啶和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥的菌株，也會顯著增強對iclaprim耐藥性，尤其是后者，其中原因需要進一步探討。

總之，iclaprim作為一種新型DHFR抑制劑，對金葡菌有很好的體外抗菌活性，如與磺胺類藥物聯合使用效果會更好，可能具有廣泛的應用前景。不過，研究中也發現了少量iclaprim MIC值較高的菌株，其機制仍需深入研究，為防控耐藥菌株的出現和傳播提供對策。